利用12C6+重离子辐射和尖孢镰刀菌毒素筛选杂交兰抗茎腐病突变体

郭和蓉 张 腾 袁红丽 曾瑞珍 张志胜,3 谢 利,*

(1 华南农业大学林学与风景园林学院，广东 广州 510642；2 华南农业大学广东省植物分子育种重点实验室，广东 广州 510642；3 国家植物航天育种工程技术研究中心，广东 广州 510642)

杂交兰(HybridCymbidium)是用国兰(ChineseCymbidium)和大花蕙兰(Cymbidiumhybridium)杂交培育的兰花新类型，集国兰和大花蕙兰的优良性状于一身，具有很高的观赏价值和广阔的市场前景[1]。茎腐病是兰花规模化生产中最严重的病害之一，尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)是该病最主要的病原菌[2-5]。感染茎腐病的兰株死亡率高达20%～30%，对兰花产业的发展构成了严重威胁[2]。目前对茎腐病主要采取化学防治[6-7]，存在成本高、污染环境等问题。选育抗病品种是防治病害最经济有效的方法，其中筛选和鉴定抗病种质是抗病育种的基础。但目前市场上流行的杂交兰品种普遍不抗茎腐病[8]。因此创建抗茎腐病杂交兰资源，对于培育抗病新品种，促进杂交兰产业高效可持续发展具有重要意义。

重离子辐射是近年来新兴的辐射诱变技术，其与组织离体培养技术相结合，具有操作简单、诱变率高、培育周期短等特点[9-14]。目前利用该技术已获得花形、花色或叶色等性状发生变异的仙客来(Cyclamen)[15]、月季(RosachinensisJacq.)[16]、美女樱(Verbenahybrida)[17]、矮牵牛(Petuniahvbrida)[18]、鼠尾草(Salviasplendens)[19]、紫露草(Tradescantiafluminensis)[20]、菊花(Chrysanthemummorifolium)[21-22]等观赏植物的突变体。突变体的离体筛选是创建抗病突变体的有效方法，目前利用该方法已获得抗疫霉菌(Phytophthoraparasitica)的粗皮柠檬(Citrusjambhiri)[23]、抗枯萎病(Fusariumoxysporump.sp.cubense)的香蕉(Musaspp.)[24]、草莓(FragariaananassaDuch.)[25]和百合(Lilium)[26]、抗叶枯病(Kabatiellamicrosticta)的大花萱草(Hemerocallishybrida)[27]突变体，但鲜见利用重离子辐射并定向筛选抗病突变体材料的报道。

玉女兰(Cym.Yunv)是华南农业大学选育出的杂交兰新品种，其株型紧凑、花型优美、花色纯正、观赏期长[28]，但栽培生产上表现出不抗茎腐病。本试验以玉女兰类原球茎为材料，采用尖孢镰刀菌为接种病原菌，研究通过重离子辐射创建抗茎腐病杂交兰突变体的技术，以期为选育抗茎腐病的兰花新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试玉女兰类原球茎(protocorm-like bodies,LBS)通过茎尖组织培养快速繁殖获得；尖孢镰刀菌从华南农业大学国家航天育种工程技术中心花卉基地感染茎腐病的玉女兰病叶中分离得到。

1.2 试验方法

1.2.1 玉女兰类原球茎的重离子辐射 选取直径约0.4 cm的类原球茎送至中国科学院兰州高能离子研究所进行12C6+重离子辐射，辐射剂量为30、50、70和90 Gy，剂量率为35 Gy·min-1。

辐射后的玉女兰类原球茎接种于增殖培养基中，在温度25±2℃、光照强度2 500 lx、光照时间13 h·d-1的条件下培养，30 d继代1次，共继代3次。每个辐射处理设3个重复，每个重复接5瓶材料，每瓶含5块类原球茎，以未辐射的材料为对照(CK)。培养过程中记录褐化、死亡的类原球茎数量，分别计算褐化率和死亡率。其中，褐化率=褐化类原球茎数/接种类原球茎数×100%；死亡率=死亡类原球茎数/接种类原球茎数×100%。增殖培养基为MS基础培养基，含有6-苄基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)1.0 mg·L-1、萘乙酸(1-naphthaleneaceticacid，NAA)0.1 mg·L-1、卡拉粉7.0 g·L-1、蔗糖30.0 g·L-1、活性炭0.1 g·L-1。

1.2.2 粗毒素滤液的制备 参考台莲梅等[29]的方法：用接种环将尖孢镰刀菌菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基上，在25℃下培养7 d，将培养出的菌落沿边缘打出直径为8 mm的菌块，接种于装有100 mL马铃薯蔗糖(potato sucrose，PSC)培养液的250 mL三角瓶中，每瓶接4块，然后将培养瓶置于控温摇床上，在25℃、120 r·min-1条件下振荡培养15 d。待菌丝体长出，营养液由混浊变为清澈时，先用2层纱布过滤掉培养液中的大量菌丝，再用2层滤纸过滤1次，将过滤后的溶液装入离心管中，3 000 r·min-1离心20 min，去沉淀后用真空泵经0.45 μm水相滤膜抽滤，再用细菌过滤器过滤灭菌，即得尖孢镰刀菌粗毒素滤液，保存在4℃冰箱内备用。

1.2.3 尖孢镰刀菌粗毒素筛选浓度的确定 将未经辐射处理的玉女兰类原球茎分别接到含0、20%、40%、60%和80%(v/v)粗毒素滤液的增殖培养基上，在26±1℃、散射光下培养30 d。每个处理3次重复，每个重复18块，15 d后记录类原球茎的存活数，计算存活率，以存活率接近50%的粗毒素浓度作为突变体筛选浓度。类原球茎存活率=粗毒素处理后存活的类原球茎数/粗毒素处理的类原球茎数×100%。

1.2.4 玉女兰抗性类原球茎的筛选 采用逐步筛选法[30]筛选抗性类原球茎。具体方法：将经50 Gy12C6+重离子辐射后和未经辐射的类原球茎接种在含20%粗毒素滤液的增殖培养基中培养30 d；随后将存活的类原球茎接入含30%粗毒素滤液的增殖培养基中培养30 d；依次增加粗毒素滤液浓度至80%(每次递增10%)，每30 d转接1次；最后将存活的类原球茎转接至不含粗毒素滤液的增殖培养基上进行增殖和分化。将分化出的高3～5 cm的苗转接到以MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+卡拉粉7.8 g·L-1+蔗糖20.0 g·L-1和活性炭0.1 g·L-1的培养基中进行生根壮苗培养，当试管苗长到7 cm左右时进行移栽。移栽基质为树皮和泥炭的混合基质(树皮∶泥炭=2∶1)，花盆直径为15 cm，在环控温室中栽培。

筛选和培养过程中记录存活的类原球茎(称为抗性系)数量、分化成苗的抗性系数量和移栽成活的抗性系数量，计算抗性系筛选率。抗性系筛选率=筛选后存活的类原球茎数/筛选前类原球茎总数×100%。

1.2.5 玉女兰抗性类原球茎防御酶活性的测定 将玉女兰抗性系类原球茎和未经处理的类原球茎分别接到含80%粗毒素滤液和不含粗毒素滤液的增殖培养基上培养，分别于0、12、24、36、48和72 h取样测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、过氧化物酶(peroxidase，POD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。具体方法：取0.3 g新鲜类原球茎加入4 mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液(pH值7.8)于冰浴中研磨成浆，转入5 mL离心管，于4℃、8 000 r·min-1离心15 min，取上清液用于酶活性测定。POD活性测定采用愈创木酚法，SOD活性测定采用NBT光化学还原法，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[31]。每个处理重复3次。

1.2.6 抗性系苗期茎腐病的抗性鉴定 采用有伤贴接法对抗性系试管苗和移栽7个月的小苗进行病原菌接种。具体方法：用无菌针从侧面中间刺入兰花假鳞茎2～3 mm，挑取直径5 mm活化好的尖孢镰刀菌菌丝块贴接于刺伤部位，每株1片，每个抗性系试管苗接种10株，小苗接种30株，以未经辐射的玉女兰类原球茎分化的试管苗和移栽7个月的小苗为对照。接种后的试管苗在空气湿度80%、温度25℃、光照强度13 000 lx、光照时间10 h·d-1的人工气候室内培养，而小苗在白天28±2℃/夜晚20±2℃、空气湿度80%、光照时间10 h·d-1、光照强度15 000 lx的环境中栽培。每日观察试管苗和小苗的发病情况，15 d后统计试管苗的存活数，25 d后记录小苗的发病情况，根据发病症状确定病情等级(表1)，计算病情指数，进行病情评价和抗病性评价。病情指数=[∑(病级株数×病级数值)/(株数总和×最高病级数值)]×100%，病情评价和抗病性评价参照方中达[32]的方法。

表1 兰花茎腐病病情分级Table 1 The disease grade of stem rot in Cymbidium

1.2.7 数据分析 采用Excel 2010对数据进行统计和作图，用SPSS 20.0进行单因素方差分析和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 12C6+重离子辐射对玉女兰类原球茎的致死效应

经不同剂量12C6+重离子辐射后的玉女兰类原球茎在增殖培养基中继代培养3个月后，其褐化和死亡情况见表2。结果表明，12C6+辐射显著提高了玉女兰类原球茎的褐化率和死亡率，且辐射剂量愈高，褐化率和死亡率愈高；当辐射剂量为50 Gy时，玉女兰类原球茎的死亡率为54.66%，接近半致死剂量。对不同辐射剂量的死亡率进行线性回归分析，计算得到玉女兰类原球茎12C6+重离子辐射的半致死剂量为49 Gy。

表2 辐射剂量对玉女兰类原球茎褐化率和死亡率的影响Table 2 Effect of irradiation dosage on mortality and browning rate of PLBs in Cym. Yunv

2.2 尖孢镰刀菌粗毒素筛选浓度的确定

尖孢镰刀菌粗毒素滤液对玉女兰类原球茎的存活有显著的抑制作用(图1)，且粗毒素浓度越高，抑制效果越明显。对不同粗毒素滤液浓度的存活率进行线性回归分析，计算得到玉女兰类原球茎的半致死浓度为80.5%。当粗毒素滤液浓度为80%时，玉女兰类原球茎的存活率为41.98%，接近半致死剂量，因此可采用80%粗毒素滤液浓度作为玉女兰抗茎腐病突变体筛选的筛选压。

注：不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。下同。Note:Different lowercase letters in the same line indicate significant difference at 0.05 level.The same as following.图1 粗毒素浓度对玉女兰类原球茎存活率的影响Fig.1 Effect of crude toxin concentration on PLBs survival rate in Cym. Yunv

2.3 玉女兰抗尖孢镰刀菌抗性系的筛选

采用图2所示的筛选流程，以尖孢镰刀菌粗毒素滤液为筛选剂，采用逐步筛选法对经50 Gy12C6+重离子辐射的300块玉女兰类原球茎进行抗茎腐病突变体筛选。当尖孢镰刀菌粗毒素滤液浓度增加到80%筛选压下，共筛选到14个抗性系类原球茎，筛选率为4.67%；其中仅有5个抗性系类原球茎分化成苗，最终有3个抗性系的试管苗移栽成活，分别为Z50Gt1、Z50Gt2和Z50Gt3；而对照组类原球茎全部死亡(图3)，即未能从未经重离子辐射的类原球茎中获得抗病突变体。

图2 玉女兰抗茎腐病突变体的筛选过程Fig.2 The screening process of mutants resistant to stem rot in Cym. Yunv

注：a～c为尖孢镰刀菌粗毒素滤液多步筛选获得的抗性系类原球茎；a：抗性系类原球茎Z50Gt1和Z50Gt2(箭示)；b：抗性系类原球茎Z50Gt3(箭示)；c：未经辐射的类原球茎；d～f为抗性系类原球茎在不含尖孢镰刀菌粗毒素滤液培养基上的增殖和分化；d：Z50Gt1；e：Z50Gt2；f：Z50Gt3；g～i为抗性系试管苗接种鉴定；g：Z50Gt3(左)和对照(右)；h：Z50Gt2；i：Z50Gt1。Note:a to c represents PLBs of resistant lines developed on the medium containing crude toxic leachate of Fusarium oxysporum. a:PLBs of resistant line Z50Gt1 and Z50Gt2 (arrow).b:PLBs of resistant line Z50Gt3 (arrow).c:PLBs of CK.d to f represents proliferation and differentiation of PLBs of resistant lines on medium without crude toxic leachate.d:Z50Gt1,e:Z50Gt2,f:Z50Gt3.g to i represents evaluation of test-tube seedling resistant to stem rot by artificial inoculation.g:Z50Gt3 (left)and CK (right).h:Z50Gt2,i:Z50Gt1.图3 玉女兰抗性系类原球茎及其组织培养和试管苗抗性鉴定Fig.3 The PLBs of resistant lines and its tissue culture,and resistant identification of its test-tube seedling in Cym. Yunv

2.4 抗尖孢镰刀菌玉女兰类原球茎防御酶活性的变化

在粗毒素浓度为80%的培养基上，抗性玉女兰类原球茎和对照的SOD活性均随处理时间增加逐渐升高，但抗性类原球茎的SOD活性始终高于对照(图4-a)，说明经筛选得到的抗性类原球茎清除氧自由基的能力增强，SOD活性的变化与其抗性增强有关。抗性玉女兰类原球茎和对照的POD活性随处理时间的延长呈先上升后下降趋势，且活性峰值均出现在处理24 h时；抗性类原球茎的POD活性始终高于对照，峰值比对照提高了867.67 U·g-1·h-1(图4-b)，说明毒素处理可诱导POD活性的增加。处理36 h前，抗性玉女兰类原球茎的MDA含量高于对照；处理36 h后，对照类原球茎的MDA含量迅速上升并高于抗性玉女兰类原球茎(图4-c)，这说明对照类原球茎对毒素胁迫更加敏感，使体内迅速累积大量的MDA，而抗性类原球茎在毒素协迫下MDA含量缓慢上升，说明其具有较强的抵御膜脂过氧化的能力。

2.5 玉女兰抗性系苗期茎腐病抗性鉴定

分别从玉女兰抗性系Z50Gt1、Z50Gt2和Z50Gt3的试管苗中选择10株苗进行尖孢镰刀菌病原菌接种鉴定，结果见表3。Z50Gt2和Z50Gt3两个抗性系试管苗分别有4株(图3-g)和2株存活(图3-h)，存活率分别为40%和20%；而抗性系Z50Gt1(图3-i)和对照试管苗全部感病死亡(图3-g)，表明Z50Gt2和Z50Gt3两个抗性系是抗茎腐病突变体。

表3 玉女兰试管苗茎腐病抗性鉴定Table 3 Resistance evaluation of test-tube seedlings in Cym. Yunv

对Z50Gt2和Z50Gt3移栽后7个月的盆栽小苗进行接种鉴定，结果表明，Z50Gt2和Z50Gt3的病情指数显著低于对照，分别为20.00%和19.33%，属于抗性级别(表4和图5)，说明经毒素筛选后的类原球茎的抗性显著高于对照。

表4 玉女兰小苗茎腐病抗性鉴定Table 4 Resistance evaluation of 7-month-old pot plants in Cym. Yunv

注：数据为平均值±标准误；*表示抗性类原球茎与对照差异显著(P<0.05)。Note:Data was presented as mean ± S.E.* indicated significant difference between resistant PLBs and control at 0.05 level.图4 玉女兰类原球茎在含毒素培养基上SOD(a)、POD(b)活性和MDA含量(c)的变化Fig.4 Changes of SOD (a),POD (b)activity and MDA content (c)of PLBs on the toxin-containing medium

注：a：接种前对照植株；b：接种前突变体植株(右Z50Gt2，左Z50Gt3)；C：接种30 d的对照植株；D：接种30 d的突变体植株(右Z50Gt2，左Z50Gt3)。Note:a:CK plants before inoculation.b:Mutants plant (right Z50Gt2,left Z50Gt3)before inoculation.c:CK plants of 30 d after inoculation.d:Mutant plants (right Z50Gt2,left Z50Gt3)of 30 d after inoculation.图5 接种前后玉女兰抗性突变体和对照小苗的表现Fig.5 Symptoms of 7-month-old pot plants from mutants and CK before and after inoculation in Cym. Yunv

3 讨论

茎腐病是兰花的主要病害，严重威胁兰花产业的高效可持续发展。玉女兰是本研究前期培育的观赏价值极高的杂交兰，在中国兰花博览会、北京世界园艺博览会等屡获大奖，市场前景十分广阔，但该品种不抗茎腐病，严重限制了其推广应用。

利用重离子辐射可获得花色、花形等性状发生变异的突变体，同时也会对辐射材料产生损伤和抑制效应。本研究发现12C+6重离子辐射对玉女兰类原球茎具有明显的致死效应，且随着辐射剂量的升高，致死效应增强，与陈臻等[33]、朱宗文等[34]和Nakano等[35]的研究结果一致。

大量研究表明，利用离体诱变、组织培养和毒素筛选技术可以较快获得抗病突变体[27,36-37]。本研究利用12C6+重离子辐射技术，结合尖孢镰刀菌粗毒素离体筛选技术，成功获得了抗茎腐病突变体植株，而在未辐射的类原球茎中未获得抗病突变体，说明重离子辐射能提高辐射材料的抗逆性，与李雪虎等[38]、薛林贵等[39]的研究结果一致。利用致病毒素筛选抗病突变体时大多采用逐步递增毒素浓度的正选择法。赵蕾等[40]认为利用毒素筛选抗性突变体时，采用多步正向选择法可选出多基因突变的突变体；刘海瑞等[41]在利用枯萎病菌粗毒素筛选香蕉抗枯萎病突变体时确定多步筛选方案为最佳筛选方案；杨媚等[24]、林丛发等[42]、苏媛等[43]和Yerzhebayeva等[44]采用逐级加压法分别获得了香蕉抗枯萎病突变体、太子参抗叶斑病突变体、草莓抗枯萎病突变体和甜菜抗尖孢镰刀菌突变体。本研究在利用尖孢镰刀菌粗毒素筛选玉女兰抗性类原球茎时，采取将粗毒素浓度从10%逐步增加到80%的多步筛选法，从300块经12C6+重离子辐射的类原球茎中获得5块具有芽分化能力的抗性类原球茎，说明采用正向多步筛选法进行兰花抗病突变体筛选是可行的。

曲玲等[45]认为由于愈伤组织细胞之间的接触较紧密，使一些细胞可能逃脱选择剂的作用而出现漏筛，因此有必要对抗性愈伤组织变异体进行鉴定。研究者们普遍采用一些生理生化指标对抗病细胞突变体进行间接鉴定，常用指标有苯丙氨酸酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)、POD、SOD、PPO等保护酶活性和MDA含量[46-50]。本试验对抗性类原球茎在毒素胁迫下的SOD、POD活性及MDA含量进行了测定，发现抗性类原球茎的SOD、POD活性均比对照高，随着毒素胁迫时间的延长，两种酶的活性均呈现先升高后降低的趋势，说明抗性变异系通过增强与抗病性相关酶的活性，以加强同植物防卫有关的物质代谢，与曲玲等[45]的研究结果一致。

对通过病原菌毒素压力选择的抗性变异体进行抗性和稳定性分析是必要的，植株接种鉴定是最直接有效的抗性鉴定方法[25,51]。程智慧等[52]利用大蒜叶枯病粗毒素离体筛选出抗叶枯病变异系，经病菌孢子悬浮液接种鉴定发现变异系苗抗病性较对照提高，通过毒素筛选获得的再生植株，后代在侵染初期通过抑制或延缓病菌的生长而达到高度的抗病性。本研究对2个抗性系7个月的盆栽小苗进行病原菌接种鉴定，结果表明，2个抗性系植株的抗病水平显著高于对照，对茎腐病的抗性均达到了抗级，与杨媚等[24]、刘海瑞等[41]、王荔等[53]的研究结果一致。

4 结论

本研究结果表明，以尖孢镰刀菌粗毒素滤液为筛选剂，采用逐步筛选法从300块经50 Gy12C6+重离子辐射过的玉女兰类原球茎中筛选出3个抗性系，Z50Gt1、Z50Gt2和Z50Gt3；3个抗性系的试管苗经人工接种鉴定表明，抗性系Z50Gt2和Z50Gt3的再生植株具有茎腐病抗性，2个抗病株系7个月大的盆栽植株病情指数分别为20.00%和19.33%，显著低于对照，达到了抗性级别。本研究结果表明通过重离子辐射结合毒素筛选是培育兰花抗茎腐病新品种的有效途径。