云锦杜鹃RhLIS基因的克隆与表达分析

王文静 吕思佳 何 凡 汪庆昊 吴月燕

(浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100)

杜鹃花为杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rhododendron)常绿或落叶灌木，是世界著名的观赏植物，广泛应用于园林种植和室内美化[1-2]。我国具有丰富的杜鹃花种质资源，但仅有少数杜鹃花种具有香气，如常绿杜鹃亚属中的云锦杜鹃(Rh.fortunei)。花香是观赏植物的重要观赏性状之一，因此花香也是评价花卉品质的一项重要指标[3]。但目前对杜鹃花的花香性状及香气物质形成机理的研究却鲜有报道[4]。

花香是植物散发出的挥发性低分子量混合物，植物的部分营养器官及花器官均可以散发芳香物质。花的香气排放量根据花的发育阶段有所不同[5]。花香可以吸引昆虫完成授粉，抵御生物胁迫以及环境变化引起的自然胁迫等[6-7]。相对于花型、花色等易于观察的植物性状，目前对花香的研究相对滞后[8]。

通过对多种植物花香化合物的成分进行分析，已明确萜烯类化合物是植物香气成分中的主要物质[9]。植物香气中萜类化合物种类多样，其中芳樟醇是萜烯类化合物的重要组成部分，是桂花(Osmanthusfragrans)[10]，百合(Lilium)[11]，康乃馨(DianthusCarnation)[12]等具香气植物的香气化合物主要成分。芳樟醇常作为香精与香水中的主要香料成分，也可作为食用香料成分[13]。研究表明芳樟醇合酶(linalool synthetase,LIS)是萜烯类化合物生物合成的重要酶，可以将香叶基焦磷酸(geranyl pyrophosphate,GPP)直接催化为挥发性物质芳樟醇[14]。通过分析拟南芥基因组序列发现，不同种萜烯类合酶基因中，75%的萜烯类合酶基因编码的氨基酸序列及蛋白质结构具有相似性，但是这些基因在生物学功能方面表现差异[15]。

章辰飞等[16]研究发现萜烯类化合物是云锦杜鹃香气成分的主要组成部分，其中芳樟醇含量较高，同时芳樟醇在云锦杜鹃花不同花期的花瓣中均存在。基于以上研究结果，推测芳樟醇可能为云锦杜鹃的主要特征香气成分。本研究以香气浓郁且萜烯类化合物含量丰富的云锦杜鹃作为试验材料，克隆杜鹃LIS基因，并对云锦杜鹃不同花期的花瓣及其他组织进行基因表达水平分析，结合芳樟醇的含量变化分析结果，以期深入探讨杜鹃花中LIS基因的功能及花香成分代谢机制，为今后利用LIS基因改良植物花香化合物含量，提高植物花香质量和观赏价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

云锦杜鹃采自宁波四明山国家森林公园(图1)，根据花被片开放程度将杜鹃花的开花过程分为4个时期：花苞期，花被未张开；半开期，花被片张开；盛开期，花被片全部开放；衰败期，花被片开始萎蔫。选取10株生长健壮且长势一致的云锦杜鹃，随机选择处于相同花期，大小相同、着色一致、无病虫害、无挤压损伤的花瓣，用蒸馏水冲洗外部杂质后立即置于液氮中，放入-80℃超低温冰箱内储存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA合成 用液氮研磨杜鹃花花瓣样品，采用植物总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取花瓣总RNA。分别用1.5%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000核酸蛋白质分析仪(上海赛默飞世尔科技)测定总RNA的完整性和浓度。按照TransScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)说明书合成cDNA第一链[17]。

1.2.2RhLIS基因克隆 从GenBank中下载与杜鹃花属植物亲缘关系较近植物的LIS基因全长序列，采用ClustalW进行多序列比对，在同源性较高的序列设计简并引物LIS-F1和LIS-R1(表1)进行PCR扩增。PCR反应总体系为50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL、cDNA模板2 μL、上下游引物各2 μL、RNase-free水19 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃保温10 min，4℃保存。根据简并引物的扩增序列设计RACE扩增引物5′GSP和3′GSP，分别扩增该基因的5′和3′端序列[18]。RACE-cDNA的合成具体操作按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit RACE试剂盒(日本宝日医生物技术有限公司)说明书进行。PCR产物经回收、连接pMD18-T Vector Cloning Kit(日本宝日医生物技术有限公司)、转化(DH5α感受态细胞)、重组子筛选及菌液PCR鉴定后，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定[19]。根据RACE拼接结果设计全长引物LIS-F2和LIS-R2，用于验证基因的全长序列。

表1 LIS基因克隆所用引物Table 1 Primers used for cloning of LIS gene

1.2.3 生物信息学分析 采用ORF finder查询开放阅读框(open reading frame,ORF)并预测氨基酸序列；采用DNAMAN 软件进行同源蛋白质序列比对；采用MEGA5.0软件构建系统进化树；采用CDD软件分析蛋白质序列的保守结构域；采用Expasy Protparam和ProtScale预测蛋白质的理化性质和疏水性/亲水性；采用NetPhos分析蛋白质的磷酸化位点；采用SOPMA预测蛋白质的二级结构；采用Swiss-Model预测蛋白质的三级结构。

1.2.4RhLIS基因表达水平的分析 按照NovoScript Plus All-in-one1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(gDNA Purge)试剂盒(日本近岸蛋白质科技有限公司)合成实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)的模板cDNA。利用 Premier5.0 软件设计qRT-PCR引物LIS-F3和LIS-R3。以杜鹃EF1α(DUH018457.1)为内参基因，按照Trans Start Tip Green qPCR SuperMixS说明书(北京全式金生物技术有限公司)进行qRT-PCR扩增。每个样品扩增时均有内参基因同时参与扩增，各样品的基因相对表达量均为 3 次生物重复的平均值，采用 2-ΔΔCT法[20]进行数据分析。

1.2.5 云锦杜鹃不同花期的花瓣及其他组织中芳樟醇含量的测定 采用顶空固相微萃取(solid-phasemicro-extraction,SPME)与气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)联用技术(SPME-GC-MS)结合内标定量法进行芳樟醇含量测定[21-22]。

1.3 数据分析

所有样品均设置3次生物学重复，试验数据采用SPSS 19.0和Excel 2010进行整理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 LIS基因的克隆

以云锦杜鹃花苞cDNA为模板，利用简并引物进行PCR扩增获得1 293 bp保守区序列(图2-A)；基于保守区序列的RACE扩增，分别获得541 bp的5′序列(图2-B)和1 259 bp的3′序列(图2-C)。利用DNAMAN软件将保守区、5′和3′序列进行比对拼接，得到LIS基因全长为2 071 bp，其中包含1 887 bp的完整ORF序列(图2-D)，编码628个氨基酸(图3)。该蛋白质的氨基酸序列中含有一段天冬氨酸保守区域(DDxxD)[23]，是金属离子结合区域，也是萜类合酶具有的典型结构。利用NCBI数据库进行BLAST序列比对，LIS基因核苷酸序列与茶树(Camelliasaluenensis)、葡萄(Vitisvinifera)、桂花的相似性分别为71%、68%和68%。

注:A:保守区扩增产物;B:5′RACE扩增产物;C:3′RACE扩增产物;D:LIS基因完整ORF区。Note:A:Conserved region sequence.B:5′RACE sequence.C:3′RACE sequence.D:LIS gene complete ORF region.图2 云锦杜鹃LIS基因PCR扩增Fig.2 PCR amplification of LIS gene in Rh. fortunei

注:方框内是起始密码子 ATG 和终止密码子TAG；DDLYD为天冬氨酸富集模体。Note:The boxes are the start codon ATG and the stop codon TAG.DDLYD is an aspartic acid enriched motif.图3 云锦杜鹃LIS基因的核苷酸及推测的氨基酸序列Fig.3 The nucleotide and deduced amino acid sequence of LIS gene from Rh. fortunei

2.2 LIS蛋白质基本理化性质与结构预测

2.2.1 LIS蛋白质保守结构域分析 LIS编码蛋白质的保守结构域分析表明，杜鹃花LIS蛋白质属于Isoprenoid-Biosyn-C1 superfamily超家族(图4)。

图4 杜鹃花LIS基因编码蛋白的保守结构域Fig.4 Conservative domains of LIS encoding protein in Rhododendron

2.2.2 LIS蛋白质生物活性分析 ProtParam分析结果表明，杜鹃LIS蛋白质的预测分子质量为72.39 kDa，等电点(pI)为5.85，说明其为酸性蛋白质；分子式为C3268H5068N860O949S25，负电荷氨基酸残基总数(Asp+Glu)为85，正电荷氨基酸残基总数(Arg+Lys)为70，不稳定系数为37.81，推测为带负电荷的稳定蛋白质，脂溶性指数为91.61，亲水性平均数为-0.269。ProtScale 分析结果表明，LIS蛋白质存在明显的疏水区和亲水区，其中第94位最高，为2.2；第50位最低，为-2.8，表明LIS蛋白质为亲水性蛋白质(图5)。

图5 杜鹃花LIS蛋白质疏水性/亲水性预测Fig.5 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic of LIS in Rhododendron

2.2.3 LIS蛋白质磷酸化修饰预测 NetPhos分析表明，杜鹃LIS蛋白存在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3个磷酸化位点(图6)，其中丝氨酸磷酸化位点44个，苏氨酸磷酸化位点35个，酪氨酸磷酸化位点24个。

图6 杜鹃花LIS蛋白质氨基酸翻译后磷酸化修饰预测Fig.6 Prediction of phosphorylation site after amino acid translation of LIS protein in Rhododendron

2.2.4 LIS蛋白质结构预测 分析杜鹃LIS编码蛋白质的二级结构发现，有393个氨基酸参与形成α-螺旋，占总氨基酸的62.58%；有173个氨基酸参与形成无规则卷曲，占总氨基酸的27.55%；有37个氨基酸参与形成延伸链，占总氨基酸的5.89%；有25个氨基酸参与形成β-转角，占总氨基酸的3.98%(图7)。表明杜鹃花LIS基因的编码蛋白质二级结构中含有丰富的α-螺旋和无规则卷曲；利用Swiss-Model工具对杜鹃花LIS基因的编码蛋白质进行三级结构建模，在蛋白质数据库中选择与LIS蛋白质序列一致性最高的蛋白质为模板进行同源模建，得到杜鹃LIS蛋白质的结构模型。与二级结构预测结果相符，含有大量α-螺旋和不规则卷曲(图8)。

注:横轴表示氨基酸位置;蓝色区域表示α-螺旋;紫色区域表示无规则卷曲;红色区域表示延伸链;绿色区域表示β-转角。Note:Horizontal axis indicated amino acid position.The blue part indicated alpha helix.The purple indicated random coil.The red part indicated extended strand.The green part indicated beta turn．图7 杜鹃花LIS 蛋白二级结构预测Fig.7 The prediction of LIS secondary structure in Rhododendron

图8 杜鹃花LIS 蛋白质三维结构预测Fig.8 Prediction of the three-dimensional structure of LIS protein in Rhododendron

2.3 LIS蛋白质序列的同源性和系统进化分析

利用DNAMAN软件对杜鹃花与其他物种LIS基因编码的蛋白质氨基酸进行同源性比对，结果如图9所示，杜鹃花与其他物种蛋白质氨基酸序列中均含有天冬氨酸富集区域(DDxxD)，但存在长度差异性和组成变异性，杜鹃RhLIS与桂花、麻疯树、莴苣LIS蛋白质氨基酸序列相似性分别为56.35%、57.96%、53.44%。为研究杜鹃花与其他物种LIS的进化关系，根据15个LIS基因的氨基酸序列构建系统进化树。由图10可知，杜鹃花LIS蛋白质与桂花的关系最近，其次与莴苣、向日葵的关系较为接近。

注:Rh:杜鹃；Of:桂花；Jc:麻疯树；Ls:莴苣；Ha:向日葵。方框中为DDxxD结构域。Note:Rh:Rhododendron simsii Planch. Of:Osmanthus fragrans. Jc:Jatropha curcas. Ls:Lactuca sativa. Ha:Helianthus annuus. The DDxxD domain was showed by box.图9 杜鹃花与其他植物LIS蛋白质氨基酸序列的多重比较Fig.9 Multiple alignment of deduced LIS amino acids sequences from Rhododendron and other plants

图10 杜鹃花LIS与其他物种LIS蛋白质的系统进化树Fig.10 Phylogenetic tree of LIS proteins in Rhododendron and other species

2.4 云锦杜鹃不同花期的花瓣及其他组织中LIS基因的表达水平分析

由图11-A可知，LIS基因在不同组织中均有表达，在4个花期的花瓣中，LIS基因的表达水平呈先上升后下降的变化趋势，且在盛开期表达量最高，这与花香挥发物质释放的规律相符合；在盛开期的花蕊中，雄蕊中LIS基因的表达水平远高于雌蕊，高达17.5倍；幼叶的LIS基因的表达水平高于老叶，高达35倍。在盛开期，花瓣(花苞期+半开期+盛开期+衰败期)中的表达量显著高于花蕊，在雄蕊中也有相对较高的表达量，其次为雌蕊，表达量最低的是老叶。

2.5 云锦杜鹃不同花期花瓣及其他组织中芳樟醇含量

根据SPME-GC-MS分析结果，云锦杜鹃不同开花期花瓣及其他组织的芳樟醇含量的测定值如图11-B。结果表明，在云锦杜鹃4个花期的花瓣中，芳樟醇含量呈现先上升后下降的变化趋势，与LIS基因的表达水平变化趋势相一致，在半开期含量最高；在盛开期的花蕊中，雌蕊的芳樟醇含量高于雄蕊；在盛开期，花瓣中芳樟醇的含量显著高于花蕊；此外，幼叶中芳樟醇的含量低于半开期的花瓣。

2.6 相关性分析

云锦杜鹃不同花期的花瓣及其他组织中LIS基因表达水平和芳樟醇含量的相关系数为0.827，表明杜鹃LIS基因与芳樟醇的合成密切相关，推测LIS参与了芳樟醇的生物合成。

3 讨论

花香是观赏植物的重要性状之一，植物体主要通过过氧化物酶体、细胞质以及内质网中的甲羟戊酸途径(mevalonate pathway,MVA)和质体中的2-甲基-D赤藓糖醇-4-磷酸途径(methylerythritol-4-phosphate pathway,MEP)，合成单帖、倍半萜、二萜等化合物[24]。近年来，通过对香气植物中花香化合物成分以及合成机制的深入探究，从仙女扇[25]、金鱼草(Antirrhinummajus)[26]及其他植物中分离纯化出花香合成途径的关键基因，发现LIS基因的表达与芳樟醇的含量密切相关；Lucker[27]在烟草植株中转入3个单萜合酶基因，转化植物体的产物中萜烯类物质β-蒎烯、柠檬烯和芳樟醇等香气化合物的含量显著上升，达到人类嗅觉感知范围，由此证明通过基因工程可以改良花香性状。

本研究中，杜鹃花LIS编码蛋白质中含有Isoprenoid-Biosyn-C1 superfamily超家族序列，且含有典型的天冬氨酸富集模体(DDxxD)结构，这与小苍兰[28]、薰衣草(Lavandulaangustifolia)[29]和丁香(Syzygiumaromaticum)[30]的研究结果相同。通过构建系统进化树发现，杜鹃LIS蛋白质与桂花、莴苣聚为一小支，与仙女扇和鸡血藤聚为一大类，在保持物种特异性的同时可能具有类似的生物学功能。本研究还发现，云锦杜鹃花瓣中LIS基因相对表达量呈现先升高后降低的变化趋势，在盛开期最高，这与百合[13]和桂花[31]的研究结果一致，同时雄蕊中LIS基因相对表达量远高于雌蕊，但是芳樟醇含量低于雌蕊。在不同花期的花瓣中，芳樟醇的含量呈现先升高后降低的变化趋势，该结果与章辰飞等[16]的研究结果相同，但是衰败期花瓣中芳樟醇含量略有不同，可能与不同时期样品的差异有关，从而导致不同批次花瓣中芳樟醇的相对含量与绝对含量变化趋势不同。本研究中芳樟醇的含量变化与LIS基因表达水平变化趋势相同，但是与前人研究相比最高值提前了一个花期，芳樟醇在半开期的花瓣中含量最高，可以推测半开期与盛开期的芳樟醇含量变化与杜鹃花花瓣吸引昆虫授粉具有重要关联。

注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Note：Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level.图11 云锦杜鹃不同花期的花瓣及花蕊LIS基因表达量与芳樟醇含量分析Fig.11 Expression analysis of LIS gene and linalool content in petals and other tissues of Rh. fortunei in different flowering stages

在云锦杜鹃中，LIS基因表达量产生巨大差异的原因可能与组织特异性相关，植物中香气化合物主要通过花瓣进行合成和排放调节，尽管在其他组织中(例如萼片、雄蕊、雌蕊和蜜腺)也有部分香气化合物的形成[32]；此外，花瓣相较于花蕊拥有更大的空气接触面积，但是在吸引昆虫传粉和授粉过程中，叶片并不是主要的香气贡献者。本研究克隆出云锦杜鹃中LIS基因，可以在后续研究中进一步确定其上游启动子的序列和功能，通过转录因子调控目标基因在时间和空间上的特定表达，最终改变花香化合物的组成与含量，完成花香植物新种质的创制，但该设想尚需要通过遗传转化等方法进行验证。此外，本研究在云锦杜鹃中只克隆得到1个LIS基因，在杜鹃花中是否存在LIS家族基因，仍需进一步研究。今后可进一步分析杜鹃花中花香合成途径中物质交换及关键基因的表达模式，为探明杜鹃花中LIS基因调控芳樟醇生物合成的机理提供理论依据。

4 结论

本研究通过RT-PCR和RACE技术首次从云锦杜鹃中克隆获得LIS基因全长cDNA序列，ORF序列长度为1 887 bp，编码628个氨基酸，生物信息学分析表明，杜鹃花LIS基因编码1个酸性、带负电荷的稳定亲水性蛋白质，属于Isoprenoid-Biosyn-C1 superfamily超家族，具有典型的DDxxD结构。LIS基因在云锦杜鹃不同花期的花瓣及其他组织中均有表达，但表达量表现出较大的差异性，云锦杜鹃中LIS基因相对表达量与香气释放规律一致，呈现先升高后降低的变化趋势；不同部位中，花瓣LIS基因相对表达量高于花蕊，幼叶高于老叶，具有组织特异性。对比芳樟醇含量变化趋势发现，杜鹃LIS基因表达水平与芳樟醇含量及香气变化密切相关。本研究结果为进一步探究杜鹃花LIS基因的功能奠定了基础，也为今后改良杜鹃花香气化合物的成分、提高花香质量和观赏价值提供了参考。