水稻淡黄叶突变体pyl3的鉴定和基因定位

胡彬华 王 平 杜安平 李 辉 王闵霞 白玉露 冀占东 蒲志刚,*

(1 四川省农业科学院生物技术核技术研究所，四川 成都 610061；2 中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041；3 三亚市南繁科学技术研究院，海南 三亚 572000)

叶色突变体对研究植物光合作用、叶绿素代谢机制以及叶绿体发育调控机理十分重要。植物叶色突变主要有白化、黄化、淡绿、深绿、条纹和斑马纹等[1]。挖掘和克隆水稻(OryzasativaL.)叶色相关基因并解析其形成机理，有利于水稻高光合效率理论与育种研究，培育高光效优良水稻新品种[2]。同时，叶色作为形态标记可用于育种材料的筛选[3-5]，也可用作观赏稻和稻田画制作[6]。研究表明，叶色变异的遗传机理主要包括细胞核遗传变异、细胞质遗传变异以及核-质互作突变，涉及多个代谢途径和信号途径，主要有叶绿素代谢途径、血红素代谢途径、叶绿体发育调控途径、核质转运途径、类胡萝卜代谢途径和嘌呤核苷酸合成途径等[7-8]。

植物光合器官由于在叶片中积累了叶绿素显示为绿色。叶绿素合成以谷氨酸作为反应起始物，经19步化学反应，涉及18种酶，最后合成叶绿素a和叶绿素b。任意一步反应异常都会导致叶色变异[9]。目前，水稻中已克隆了14个直接参与叶绿素合成的基因[7-8]。自然界中的光合器官能合成两类四吡咯(tetrapyrroles)：叶绿素(chlorophyll，Chl)和亚铁血红素(heme)。血红素与叶绿素含量之间存在相互抑制[10]；原卟啉(protoporphyrin Ⅸ)是这两类色素合成的共同中间体。在合成叶绿素分支反应中，Mg-原卟啉Ⅸ螯合酶(Mg螯合酶)催化Mg2+插入原卟啉合成Mg-原卟啉Ⅸ，该反应需要ATP供能，是合成叶绿素反应的第一步，也是叶绿素合成最复杂的一步[11]。而亚铁螯合酶(ferrochelatase)催化原卟啉的螯合反应是合成亚铁血红素分支反应的第一步，该反应不需要ATP供能。Mg螯合酶是由CHLD、CHLH和CHLI组成的异源三聚体，亚铁螯合酶则是同源二聚体[12]。早期研究表明，只有3个亚基CHLD、CHLH和CHLI按两步法结合在一起时，Mg螯合酶才具有催化合成叶绿素的活性[10,13-16]。水稻中CHLD、CHLH和CHLI分别编码水稻Mg螯合酶的3个亚基，其突变体中叶绿素含量降低，表现为水稻黄化或白化[11,17-19]。此外，叶绿素合成途径中其他关键酶基因的突变也会导致叶色变异，如编码叶绿素合成酶的基因YGL1(yellowgreenleaf1)[20]、编码镁原卟啉Ⅸ单酯环化酶的基因YGL8(yellowgreenleaf8)[21]、编码联乙烯还原酶的基因OsDVR(divinylreductasegene)[22]、编码镁原卟啉Ⅸ甲基转移酶的基因CHLM(Mg-protoporphyrinⅨmethyltransferase)[23]、编码叶绿素a加氧酶的基因CAO1 (chlorophyllaoxygenase)[24]、编码粪卟啉原Ⅲ氧化酶的基因RLIN1 (ricelesioninitiation1)[25]、编码原叶绿素酸酯氧化还原酶B的基因PORB(protochlorophyllideoxidoreductaseB)[26]，这些基因的突变会导致水稻叶片出现黄色转绿、黄绿色、类病斑和黄白花斑和坏死病斑等表型。

本研究在籼稻骨干恢复系川恢907的60Co-γ辐射诱变突变体库中筛选到一份淡黄叶突变体pyl3，从苗期开始该突变体整个生育期都表现出淡黄叶表型。本试验对该突变体的表型特征和主要农艺性状进行鉴定，以及对遗传分析、基因定位以及叶绿素合成与光合作用相关基因的表达分析等进行研究，旨在为探究叶色变异分子调控机理和水稻高光效育种应用提供新的材料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻淡黄叶突变体paleyellowleafmutant3(pyl3)来源于籼稻恢复系亲本川恢907 (R907)的60Co-γ辐射诱变突变库，经回交3代和多代自交后，其淡黄叶表型能稳定遗传。

1.2 叶绿素含量测定

采用Lichtenthaler[27]的方法测定叶绿素和类胡萝卜素的含量。取野生型和突变体pyl3植株苗期叶片，液氮研磨，称取0.2 g样品粉末，加入95%的乙醇在黑暗中处理48 h后，用Thermo BioMate 3S分光光度计(Thermo Scientific,美国)分别测量470、645和663 nm波长下浸提液的吸光度值，计算叶绿素(chlorophyll，Chl)、叶绿素a(chlorophyll a，Chla)、叶绿素b(chlorophyll b，Chlb)及类胡萝卜素(carotenoid，Car)含量，每个样品进行3次生物学重复，结果取平均值。

1.3 农艺性状调查

在水稻成熟后测定野生型和pyl3突变体的株高、有效穗、穗长、穗粒数、粒长、粒宽、千粒重与结实率等主要农艺性状，每个性状10次重复，并采用t-检验法分析突变体与野生型之间的差异显著性。

1.4 定位群体的构建和遗传分析

以突变体pyl3为母本，分别与野生型R907和籼稻9311杂交，获得杂交F1种子；F1植株再自交得到F2种子，分单株收取F2种子进行种植。观察杂交F1和F2植株叶片的颜色表型并进行遗传分析；以突变体pyl3和粳稻02428杂交构建的F2群体作为基因定位群体。

1.5 DNA提取和基因定位

在pyl3/02428的F2群体中随机选取262株淡黄叶表型的单株作为定位植株，采用CTAB法提取叶片DNA[28]。利用分布于12条染色体上，在pyl3突变体与02428之间具有多态性的简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)和插入缺失(insertion-deletion,InDel)标记进行初步定位，确定淡黄叶基因的定位区间。随后选取F2群体中25个极端黄化单株叶片进行等量混合后提取基因组DNA，同时提取野生型DNA，送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组重测序，采用基于BSA全基因组重测序的分析方法进行基因定位[29]。基因定位引物见表1。

1.6 候选基因的分析

BSA基因定位分析以MSU-RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)为参考基因组进行比对分析，在利用分子标记进行基因初步定位结果的基础上，筛选完全连锁的候选基因，对候选基因突变位点设计测序引物，在野生型和突变体间进行PCR扩增和测序验证。引物合成和测序由北京擎科生物工程有限公司成都分公司完成。

1.7 突变位点氨基酸序列比对分析

用水稻CHLI的氨基酸序列在已测序植物数据库(http://www.phytozome.net)中进行比对分析，获取不同物种中镁离子螯合酶Ⅰ亚基CHLI的氨基酸序列，筛选与水稻CHLI序列同源度较高的8个物种的氨基酸序列，用DNAMAN7进行比对分析。

1.8 RNA的提取与qRT-PCR

取野生型和pyl3突变体的苗期叶片立即用液氮冷冻研磨，采用Omega(Omega Bio-Tek,美国)植物RNA提取试剂盒(RNeasy plant mini kit)提取叶片总RNA，采用宝生物工程(大连)有限公司的TaKaRa反转录试剂盒进行反转录。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)采用KAPA SYBR荧光定量PCR试剂(Kapa Biosystems,美国)，用CFX-96实时荧光定量PCR仪(BioRad，美国)检测野生型和pyl3突变体中相关基因的表达。以水稻Actin基因作为内参基因，每个样品分别设3次生物学重复和3次技术重复，以2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量，qRT-PCR相关基因引物见表1。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences for this study

2 结果与分析

2.1 pyl3突变体的表型特征及农艺性状分析

与野生型相比，pyl3突变体叶色具有明显的差异；从苗期起开始pyl3出现明显的淡黄叶表型，此后在整个发育过程中都保持淡黄叶表型(图1-A～C)。成熟后对野生型和突变体进行农艺性状统计分析，结果显示，与野生型相比，pyl3突变体的株高、穗长，穗粒数和结实率分别显著减少16.29%、14.91%、16.73%、17.93%，有效穗和千粒重无显著差异(表2)。

表2 野生型和pyl3突变体的主要农艺性状Table 2 The agronomic traits of wild-type (WT)and mutant (pyl3)

图1 野生型和pyl3突变体在苗期(A)和分蘖期(B)的植株形态以及分蘖期叶片表型(C)Fig.1 The phenotype of wild-type (WT)and pyl3 mutant at the seedling (A)and tillering (B)stages and flag leaf at tillering stage (C)

2.2 pyl3突变体的光合色素含量分析

为了确定pyl3突变体的淡黄叶表型是否由光合色素含量变化导致，试验在苗期对野生型和pyl3突变体的光合色素含量进行了测定。结果显示，突变体pyl3的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量均显著低于野生型(图2)。表明突变体pyl3的淡黄叶表型主要是光合色素含量下降所致。

图2 野生型和pyl3突变体在苗期的光合色素含量比较Fig.2 Comparison of photosynthetic pigment contents between wild-type (WT)and pyl3 mutant at seeding stage

2.3 pyl3的遗传分析

为了分析pyl3突变体淡黄叶表型的遗传特性，将其分别与野生型R907和叶色正常的籼稻9311杂交，观察F1和F2植株的表型。pyl3/R907和pyl3/9311后代群体的观察与统计分析结果表明，2个杂交组合F1植株叶片颜色均表现为正常，进一步统计F2群体中正常叶色和淡黄叶表型的植株数，卡方(χ2)测验结果显示正常绿叶与淡黄叶植株的分离比例符合3∶1(表3)，表明pyl3突变体的淡黄叶表型是由1对隐性核基因控制。

表3 pyl3突变体基因的遗传分析Table 3 Genetic analysis on pale yellow leaf phenotype of pyl3 mutant

2.4 pyl3突变基因的定位

为了定位和克隆pyl3基因，本研究利用108对具有多态性的SSR标记和12对InDel分子标记进行pyl3的基因定位，利用分子标记连锁分析的方法将pyl3基因定位于水稻第3号染色体长臂上的InDel标记M4和M6之间、物理距离约为3.2 Mb的区间内(图3-A)。

2.5 候选基因序列分析

为了克隆pyl3基因，在初步定位结果基础上，进一步利用基于BSA全基因组重测序方法进行联合分析(图3-B)。以日本晴基因组序列作为参考序列，分析结果发现在初定位的3.2 Mb的区间内有1个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与突变表型完全连锁(SNP index=1)，该SNP位于编码镁离子螯合酶Ⅰ亚基的ChlI/Chl9(LOC_Os03g36540)基因内(表4)。分别扩增野生型和pyl3突变体的ChlI/Chl9基因并进行测序分析，DNA测序分析结果显示，pyl3突变体在ChlI/Chl9基因第3外显子上编码区第1 034位碱基由C突变为T，导致其编码氨基酸的第345位的半胱氨酸(Cys)突变为酪氨酸(Tyr)(图3-C、D)。进一步对水稻、高粱、甘蓝、玉米、陆地棉、可可树、木薯、二穗短柄草和拟南芥中CHLI蛋白的同源序列进行比对分析，结果发现该突变氨基酸即第345位处的野生型氨基酸在不同物种中高度保守(图3-E)。

表4 BSA分析定位区间的候选基因Table 4 BSA analysis of the candidate gene within the mapped interval

2.6 叶绿素合成与光合作用途径相关基因的表达

为了研究pyl3突变体中ChlI/Chl9pyl3基因突变对叶绿素合成和光合作用途径的影响，进一步利用qRT-PCR对这些途径相关基因的表达量进行分析。结果表明，与野生型相比，在pyl3突变体中编码原叶绿素酸酯氧化还原酶B基因PORB、叶绿素a加氧酶CAO1、联乙烯还原酶基因DVR和叶绿素合酶基因YGL1的表达显著上调；编码谷氨酰-tRNA还原酶HEMA1、NADPH原叶绿素酸酯氧化还原酶A基因PORA、镁离子螯合酶D亚基、H亚基和Ⅰ亚基基因CHLD、CHLH和CHLI的表达无显著变化(图4-A)。在光合作用相关基因中，编码捕光叶绿素a/b结合蛋白的基因Cab1R，编码光反应中心蛋白的基因PsaA以及编码PSII反应中心蛋白的基因PsbA表达量均显著上调；分别编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基和小亚基基因的RbcL和RbcS表达量显著下调；捕光叶绿素a/b结合蛋白基因Cab2R表达无显著变化(图4-B)。

注：A：pyl3基因定位到第3号染色体InDel标记M4和M6之间；B：基于BSA全基因组重测序分析候选基因；C：测序分析候选基因突变位点；D：Os03g36540基因结构，黑色方框代表外显子，灰色方框代表UTRs，黑色线条代表内含子，以及chl9、ell和pyl3三个等位基因的不同突变位点；E：不同物种中CHLI 同源蛋白氨基酸序列比对，其中OsCHLI、SbiCHLI、BolCHLI、ZmaCHLI、GraCHLI、TcaCHLI、MesCHLI、BdiCHLI和AthHLI分别代表水稻 (Oryza sativa L.)、高粱 (Sorghum bicolor)、甘蓝 (Brassica oleracea)、玉米(Zea mays L.)、陆地棉 (Gossypium hirsutum Linn.)、可可树 (Theobroma cacao)、木薯 (Manihot esculenta)、二穗短柄草 (Brachypodium distachyon)和拟南芥 (Arabidopsis thaliana)；红框代表CHLI/CHL9 pyl3蛋白突变位点处的氨基酸。Note:A:Primary mapping of pyl3 gene,the which was primarily mapped between InDel markers M4 and M6 on the long arm of chromosome 3.B:Mapping pyl3 by BSA based whole genome resequencing analysis.C:Sanger sequencing analysis the mutation site of candidate gene.D:Structure of LOC_Os03g36540. Black boxes indicate exons,gray color boxes indicate UTRs,black lines indicate introns and the corresponding mutation sites of the different three alleles of chl9,ell and pyl3 are marked by black line in the third exon,respectively.E:Amino acid sequence alignment of CHLI homologous proteins in different species by DNAMAN software.OsCHLI,SbiCHLI,BolCHLI,ZmaCHLI,GraCHLI,TcaCHLI,MesCHLI,BdiCHLI,and AthHLI represent Rice (Oryza sativa L.),Sorghum (Sorghum bicolor),Cabbage (Brassica oleracea),Maize (Zea mays L.),Upland cotton (Gossypium hirsutum Linn.),Cacao tree (Theobroma cacao),Cassava (Manihot esculenta),Purple false brome (Brachypodium distachyon)and Arabidopsis (Arabidopsis thalianathe),respectively.Red box indicates the amino acid at the mutation site of CHLI/CHL9 pyl3 in different species.图3 pyl3基因的定位与候选基因分析Fig.3 Molecular mapping and candidate gene analysis of pyl3 gene

3 讨论

叶片是植物光合作用的主要场所，叶色通常直接或间接受光合色素合成途径相关基因的调控。叶绿素在植物收集光能进行光合作用和转换能量过程具有至关重要的作用。高等植物的叶绿素生物合成是一系列复杂的过程[9,30]。该代谢途径中相关基因发生突变可能影响叶绿素的合成，从而引起不同程度的叶色变异，严重时可能导致植株死亡[18,31]。前人研究表明在叶绿素合成过程中叶绿素酸酯a是叶绿素a和叶绿素b的前体，叶绿素酸酯a分别在叶绿素合酶和叶绿素酸酯a氧化酶的催化下合成叶绿素a和叶绿素酸酯b，叶绿素合酶催化叶绿素酸酯b生成叶绿素b[9]。本研究中，突变体pyl3叶片中叶绿素含量显著降低(图2)，说明叶绿素合成过程中相关酶的功能可能受到影响，导致突变体叶绿素合成途径受阻、光合作用出现异常，使突变体出现淡黄叶表型，导致农艺性状发生改变(表2)。

通过分子标记连锁分析和基于BSA全基因组重测序的定位方法，确定了pyl3突变体是由于叶绿素合成酶基因CHLI的突变所致。研究表明CHLI编码415个氨基酸的Mg螯合酶亚基Ⅰ，该蛋白的C-末端从第93到第415位氨基酸有一个保守的AAA+的Mg螯合酶结构域[32]。水稻中已报道的CHLI基因突变体有chl9和ell；其中，chl9在CHLI编码区919位由C变成T，造成307位的精氨酸变成半胱氨酸，导致叶绿素合酶活性降低，影响了叶绿体的发育和光合作用，最终导致叶绿素含量下降而表现出全生育期的黄化[12]。ell突变发生在CHLI编码区的529位，导致其保守区域编码的第177位氨基酸由G突变为R，阻碍了CHLI和CHLD亚基的互作，导致水稻叶片叶绿素合成受阻以及三叶期后致死[18]。本研究中不同物种镁离子螯合酶Ⅰ亚基的氨基酸序列分析表明，pyl3突变体携带的CHLI/CHL9pyl3蛋白的第345位突变位点位于AAA+ Mg螯合酶结构域内，并且该突变位点处对应的野生型半胱氨酸在水稻和拟南芥等高等植物中高度保守(图3-D)，说明该位点的半胱氨酸可能对该蛋白的正常功能具有至关重要的作用。虽然chl9、ell与pyl3三个突变体的突变位点都发生在保守的AAA+的结构域内，但ell的突变在该结构域靠前的位置，导致ell突变体在三叶期致死，可能功能缺失更为严重；而pyl3和chl9的突变在AAA+的结构域靠后的位置，虽然这两个突变体与ell具有相似的表型，但不是致死突变。因此，相对于ell突变体，pyl3和chl9是CHLI基因的弱等位变异，可能是在CHLI基因不同位置发生突变导致编码的蛋白具有不同功能所致。

基因表达分析结果表明，PLY3/CHLI基因在pyl3突变体中的表达与野生型相比变化不显著(图4-A)，同时该突变位点是AAA+结构域中的保守位点(图3-E)，表明PLY3/CHLI基因突变对功能的影响可能是通过改变氨基酸序列从而影响蛋白的功能，而不是通过改变转录水平影响。因此，CHLI的突变导致其功能的变化，使得叶绿素合成途径受到抑制，降低核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基和小亚基基因的RbcL和RbcS基因的表达(图4-B)。此外，在pyl3突变体中可能还存在反馈调控机制，当CHLI/CHL9pyl3突变影响其编码蛋白功能后，反馈调控机制可能反向上调了其他叶绿素合成相关基因PORB、CAO1、DVR和YGL1以及光合作用相关基因Cab1R、PsaA和PsbA的表达(图4)，以弥补CHLI/CHL9pyl3基因突变的影响。但是，反馈调控机制可能无法完全弥补CHLI/CHL9pyl3基因突变对叶绿素合成和光合作用途径的影响，从而影响叶绿体的发育，造成叶绿素含量降低，最终导致pyl3突变体呈现淡黄叶表型。

4 结论

本研究通过辐射诱变获得了一份淡黄叶突变体pyl3。与野生型相比，pyl3突变体在水稻生长的全生育期均表现出淡黄叶表型，叶绿素和类胡萝卜素含量显著降低。相比野生型，pyl3突变体株高降低，结实率、穗长和穗粒数等农艺性状指标下降。遗传分析结果表明，pyl3的突变表型受一对隐性核基因控制。利用分子标记连锁分析与基于BSA全基因组重测序的联合基因定位结果表明，pyl3的突变表型是由编码Mg-原卟啉Ⅸ螯合酶CHLI亚基的基因编码区第1 034碱基突变所致，导致编码的第345位的氨基酸发生变化，从而引起叶片中叶绿素合成和光合作用相关基因的表达发生变化。pyl3突变体携带的CHLI/CHL9pyl3基因是已报道的水稻chl9/chli浅黄绿叶基因的新等位基因，而pyl3也是CHLI/CHL9基因的新等位突变体；二者的发现为进一步研究CHLI/CHL9基因的功能和水稻叶色形成调控的分子机制提供了新的研究材料与基因资源。