HSP27基因在牦牛卵母细胞和体外早期胚胎中的表达

刘敏清 何翃闳 潘阳阳 张慧珠 王亚营 杨珊珊 崔 燕 余四九

(甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,甘肃 兰州 730070)

牦牛(Bosgrunniens)是生活在高寒低氧环境的原始牛种之一，可在严寒和饥饿环境中进行正常的生命活动[1]。在高海拔地区，牦牛不仅承担着农牧民的农耕劳作，还发挥着必要的运输作用，是高海拔地区农牧发展的重要畜种[2]。但牦牛的生产性能较低，繁殖周期为三年两胎或两年一胎，极大影响了牦牛资源的利用。因此，与牦牛生殖繁育功能有关的基因或蛋白具有很重要的研究意义。

热休克蛋白(heat shocks proteins，HSPs)是一组能够逆转或抑制细胞蛋白质在高温应激下变性或去折叠的蛋白质[3]。当生物体受到环境胁迫时，HSP作为分子伴侣在蛋白质的形成中发挥着重要作用，且极大地增加了细胞对各类应激的生理耐受性[4]。根据分子量的大小和同源程度可将其分为小分子量HSP(15～30 kDa)、HSP60(30～70 kDa)、HSP70(30～70 kDa)、HSP90(大于80 kDa)、HSP110(大于80 kDa)和泛素6个家族，普遍存在于动物体内[5]。作为小分子量热休克蛋白亚家族的重要代表成员之一，热休克蛋白27(heatshockproteins27，HSP27)是一种可以抑制细胞凋亡的凋亡调节因子[6]。有研究表明，雌性卵巢内促凋亡因子和抗凋亡因子之间存在着不平衡关系[7]，这种关系与雌性生殖有重要联系。在细胞没有受到胁迫时，HSP27主要以无活性的大聚合体形式存在且表达量较低；当细胞受到胁迫时，HSP27会发生磷酸化反应被激活，从而促进蛋白质的正确折叠、组装和纠正蛋白质的错误结构等一系列生物学功能，同时表达量增加[8]。HSP27具有很强的抗凋亡特性，通过与凋亡途径中caspase介导激活的成分直接作用，在凋亡相关损伤中发挥保护作用[9-10]。早期的研究表明HSPs在受精和附植前对卵子、精子和胚胎发生发育都有重要作用[11]。近年来有研究发现，HSP27在人卵母细胞中可以表达，并在卵母细胞的发育过程中发挥作用[12]。在小鼠体内，当HSP27下调时可促进小鼠卵母细胞成熟，同时通过激活外源性caspase 8介导的凋亡途径，促进卵母细胞早期凋亡，HSP27的下调与卵母细胞成熟呈正相关[13]。卵母细胞的正常发育、成熟以及早期凋亡等生理活动中均有HSP27的参与，其中过表达的HSP27并不影响受精率，反而提高了卵母细胞的胚胎发育潜能[14]。随着热休克蛋白进入人们的视野，其诸多功能逐渐被证实，其在胚胎发育中的功能研究也相应增加。例如研究发现HSP27在人类胚胎发育早期就有表达，HSP27的表达在细胞、分化、分裂和凋亡中发挥着重要作用[15-16]。Bahr等[17]研究表明，在羊的生殖生理过程中，子宫内发育比较迟缓的羊胎儿，HSP27的表达逐渐增加。同时有研究表明，过表达HSP27在卵巢细胞成熟过程中可以维持细胞的稳定性，同时提高细胞对热应激的耐性能力，从而发挥对细胞的保护和抑制凋亡作用[18-20]。本课题组前期研究发现，牦牛HSP27基因在牦牛黄体期的各个主要生殖器官中存在表达差异，而HSP27的表达在妊娠期子宫、输卵管和卵巢中呈现显著降低趋势，可见HSP27基因在雌性牦牛生殖器官中发挥了一定的作用[21-22]。

以上研究表明，HSP27对于哺乳动物胚胎的发生发育发挥着重要作用，由此推测HSP27基因在牦牛妊娠调控等繁殖生理过程中具有重要意义。孤雌激活是指处于第二次减数分裂中期的成熟卵母细胞不经过精子受精作用，而在某些理化因素的刺激下继续生长发育的过程，包括恢复并完成第二次减数分裂，发生卵裂形成早期胚胎[23]。卵母细胞的体外培养孤雌激活技术是研究哺乳动物受精机制以及其孤雌生殖的重要方法之一，也是研究细胞核移植的关键技术[24]。目前，国内外尚鲜见关于HSP27在牦牛卵母细胞和胚胎中表达的报道。本研究以牦牛为未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞以及孤雌激活2～4细胞期、5～8细胞期、桑椹期和囊胚期的胚胎作为研究对象，通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和免疫荧光染色法研究牦牛HSP27在牦牛卵母细胞以及不同时期孤雌激活胚胎中是否存在表达差异，旨在为后续探讨HSP27在牦牛卵母细胞成熟和早期胚胎发育中发挥的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品采集

根据牦牛发情季节于2019年8-9月在青海西宁乐家湾屠宰场，在确保无菌环境下采集完整的牦牛卵巢，置于含有双抗(100 IU·mL-1青霉素和0.05 mg·mL-1链霉素)的25～30℃的生理盐水中，短时间内送回实验室；用35℃含100 IU·mL-1青霉素和0.05 mg·mL-1链霉素的无菌生理盐水清洗3～5次，使用带有18号针头的一次性塑料注射器，在无菌条件下采集卵巢表面凸起且直径为2～8 mm之间发育卵泡中的卵泡液和卵母细胞，在BX51-DP71体视显微镜(日本Olympus公司)下选择外在形态大小均一、无异常形态，被紧密排列的卵丘细胞紧密包裹的卵丘-卵母细胞复合体(cumulu-oocyte complex,COCs)。

1.2 卵母细胞培养

在体式显微镜下，使用无菌采卵针将选择出的优良COCs在培养皿中清洗3次，清洗液为添加有5% 胎牛血清胎(fetal bovine serum，FBS)(美国Hyclone公司)的杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s phosphate buffered saline,DPBS)溶液。提前在培养箱(5% CO2、38℃)中预平衡成熟液[10% FBS +卵母细胞体外成熟培养液(TCM199)+100 μg·mL-1雌二醇+100 μg·mL-1促黄体素+100 μg·mL-1促卵泡素+100 μg·mL-1链霉素+100 μg·mL-1青霉素]，再将COCs放置于成熟液中培养，三气培养箱(美国Thermo公司)设定的培养条件为湿度饱和、CO2浓度5%及温度38℃。培养至卵母细胞内第一极体出现，认为是卵母细胞的成熟标志。

1.3 卵母细胞的孤雌激活及胚胎的培养

使用DPBS液将体外培养成熟的牦牛卵母细胞清洗3～4次，后将成熟的卵母细胞在培养液(添加有1‰的透明质酸酶)进行消化并用采卵针缓慢吹打，实时观察卵母细胞与卵丘细胞是否分离，直至成为不含有卵丘细胞的卵母细胞，将卵母细胞在添加有FBS的DPBS溶液中用采卵针清洗3～4次。选择形态正常、胞质均一、卵周隙明显且排出第一极体的卵母细胞，将其在离子霉素液滴中平衡5 min，借助BTX-450的电融合槽(BTx，美国)的作用将平衡后的卵母细胞进行激活，用TCM199液继续清洗激活后的卵母细胞，最后将卵母细胞培养于6-甲基氨基嘌呤(6-Dimethylaminopurin,6-DMAP)(2 mmol·L-1)的微滴液中4 h，使卵母细胞完全激活。

用采卵针将激活后培养的卵母细胞转移至SoFaa培养液(石蜡油覆盖，提前在培养箱内平衡2 h)，在每个100 μL 的液滴里约有20个激活后的卵母细胞，将激活后的卵母细胞转移至培养箱(饱和湿度、5% CO2、38℃)中培养，根据胚胎各时期发育所需时间，记录培养时间并于具体时间收集各时期胚胎并保存。

1.4 试验引物的设计

根据GenBank数据库中公布牛HSP27基因的编码区，选择GAPDH为内参基因，应用Primer Premier 5.0 软件设计特异性引物。本试验所涉及引物均由北京华大合成。

表1 引物序列及长度Table 1 Primer sequence and length

1.5 各时期样品RNA提取及RNA反转录

将未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞(每个试验组各50个)以及体外培养孤雌激活不同时期的胚胎组(每个试验组各20枚胚胎)，用PBS缓慢清洗3次，用微量样品RNA提取试剂盒(美国Omega公司)，分别提取未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞以及孤雌激活各时期胚胎总RNA，再使用Go ScriptTMReverse Transcription System(美国Promega公司)将RNA反转录成cDNA模板，保存于-20℃备用。

1.6 牦牛HSP27基因的扩增

以反转录后未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞以及体外培养孤雌激活不同时期胚胎的cDNA为反应模板，分别以GAPDH和HSP27为反应引物，进行PCR。PCR总反应体系为20 μL：Taq PCR Master Mix 10 μL，无菌去离子水8 μL，模板1 μL，上下游引物各0.5 μL。PCR反应条件：95℃预变性4 min；95℃变性30 s；60℃退火30s；72℃延伸25 s(HSP27)或15 s(GAPGH)，35个循环；72℃终延伸10 min，4℃保存。应用10 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测。

1.7 qRT-PCR检测HSP27基因的表达

引物HSP27和引物GAPDH对HSP27基因在牦牛未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞以及不同时期孤雌激活胚胎中的表达水平使用实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche生物)进行检测。将牦牛未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞以及体外培养孤雌激活不同时期胚胎分为6试验组别，每个组分别有试验孔、内参孔和空白孔。qRT-PCR总反应体系为20 μL：模板1 μL、SYBR Premix Dimer EraserTM(2×)[宝生物工程(大连)有限公司TaKaRa]10 μL、无菌去离子水 7.4 μL、上下游引物各0.8 μL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性4 s，60℃退火34 s，40个循环。反应检测各试验组熔解曲线，每组重复进行3次。使用统计学SPSS21.0 软件对试验数据进行处理分析，HSP27基因的相对表达量用2-ΔΔCt法计算。

1.8 免疫荧光染色检测HSP27蛋白的表达

在室温条件下，将牦牛未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞以及体外培养孤雌激活不同时期胚胎分别使用免疫染色固定液固定0.5 h，用免疫染色洗涤液清洗各试验组样品。免疫染色封闭液分别封闭各试验组样品0.5 h，将牦牛未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞以及不同时期的孤雌激活胚胎放置于HSP27抗体(ab79868，美国Abcam公司)中4℃过夜，清洗3次，山羊抗鼠的二抗IgG(北京博奥森生物技术有限公司)(1∶100 稀释)孵育1 h，清洗3次，最后封片。在BX51-DP71荧光倒置相差显微镜(日本Olympus公司)下观察6组试验组免疫荧光染色结果并拍照。

2 结果与分析

2.1 卵母细胞及不同时期孤雌激活胚胎在的培养

通过倒置相差显微镜观察牦牛卵母细胞以及体外培养孤雌激活不同时期胚胎的发育情况(图1)。牦牛未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞以及胚胎的发生发育情况均较好，挑选发育较好的牦牛未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞以及体外培养2～4细胞期胚胎、5～8细胞期胚胎、桑椹胚和囊胚期的胚胎，分别收集6个试验组样品并保存于-80℃超低温冰箱，以备后续试验使用。

注：A：未成熟卵母细胞；B：成熟卵母细胞；C：2～4细胞期；D：5～8细胞期；E：桑椹胚；F：囊胚期胚胎。标尺为200 μm。Note:A:Immature oocytes.B:Mature oocytes.C:2～4 cell.D:5～8 cell.E:Mulberry embryo.F:Blastocyst embryo.Bar is 200 μm.图1 牦牛卵母细胞及孤雌激活各时期胚胎发育情况Fig.1 Embryo development of yak oocytes and parthenogenetic activation

2.2 HSP27基因在牦牛卵母细胞及孤雌激活不同时期胚胎中的扩增

使用10 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果见图2。图2-A为HSP27基因的扩增产物，其明显条带出现在182 bp处，与设计产物长度大小基本一致。图2-B为GAPDH基因的扩增产物，大小为129 bp，验证了反转录所得cDNA模板可用于后续试验。

注：M：DL2000 DNA相对分子质量标准；1:未成熟卵母细胞；2：成熟卵母细胞；3:2～4细胞期胚胎；4:5～8细胞期胚胎；5：桑椹胚；6：囊胚期。Note:M:DL2000 DNA Marker.1:Immature oocytes.2:Mature oocytes.3:2～4 cell.4:5～8 cell.5:Mulberry embryo.6:Blastocyst embryo.图2 HSP27 和 GAPDH基因扩增Fig.2 HSP27 and GAPDH gene amplification

2.3 qRT-PCR检测牦牛HSP27基因的表达

qRT-PCR分析结果表明，HSP27和GAPDH基因PCR产物的退火温度值都比较单一，有单一的熔解峰。由图3可知，HSP27基因在牦牛未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞以及体外培养孤雌激活不同时期胚胎中均可表达，其中在卵母细胞中，未成熟卵母细胞表达量显著高于成熟卵母细胞的表达量(P<0.05)。在胚胎时期，表达量最高是体外培养孤雌激活2～4细胞期胚胎，表达量最低是囊胚期胚胎，随着胚胎的不断发育，HSP27的表达量逐渐降低；在体外培养孤雌激活2～4细胞期胚胎和囊胚期胚胎中的表达分别与其他组相比差异显著，而在体外培养孤雌激活5～8期胚胎和桑椹胚之间的表达差异不显著。

卵母细胞及孤雌激活各时期细胞Yak oocytes and parthenogenetic activation注：不同字母之间表示差异性显著(P<0.05)。下同。Note:Different letters indicate significant differences at 0.05 level.The same as following.图3 牦牛HSP27基因的表达水平Fig.3 Expression level of yak HSP27 gene

2.4 免疫荧光染色检测牦牛HSP27在卵母细胞及孤雌激活不同时期胚胎中的分布及表达

免疫荧光染色结果显示，HSP27蛋白在牦牛卵丘细胞和卵母细胞中均有表达，在体外培养孤雌激活2～4细胞期胚胎、5～8细胞期胚胎和桑椹胚中主要存在于细胞核内和细胞质中，在囊胚期主要存在于细胞核中(图4)。HSP27蛋白在牦牛未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞以及体外培养孤雌激活不同时期胚胎中均有表达，其中在卵母细胞时期，未成熟卵母细胞表达量显著高于成熟卵母细胞的表达量。在胚胎时期，HSP27蛋白表达量最高是在体外培养孤雌激活2～4细胞期胚胎中，表达量最低是在体外培养孤雌激活囊胚期胚胎中，伴随着胚胎的不断发育，HSP27蛋白的表达量逐渐降低(图5)。

注:标尺=50 μm。DAPI：4’-6-二脒基-2苯基吲哚Note:Bar=50 μm.DAPI:4’-6-diamidino-2-phenylindole图4 牦牛卵母细胞及孤雌激活不同时期胚胎中HSP27蛋白的分布Fig.4 Distribution of HSP27 protein in yak oocytes and parthenogenetic embryos at different stages

卵母细胞及孤雌激活各时期细胞Yakoocytes and partheogenetic activation图5 牦牛HSP27蛋白的表达水平Fig.5 Expression levels of yak HSP27 protein

3 讨论

哺乳动物卵母细胞成熟是决定胚胎发育的重要因素之一。近年来，人们对体外培养的卵母细胞早期凋亡与卵母细胞发育能力的关系进行了大量研究。研究表明，卵母细胞早期凋亡相反地降低了卵母细胞的发育能力[25]。在正常卵巢组织内，随着卵母细胞的发育，卵巢中HSP27的表达降低[26]。本试验中，HSP27在牦牛未成熟卵母细胞在基因和蛋白水平均高于成熟卵母细胞，这与前人研究结果一致。同时发现了卵母细胞的发育与其周围的颗粒细胞是相互依赖的[15]，由于关于HSP27在卵母细胞中的作用的报道很少，推测这一点可能与卵丘颗粒细胞有关。

热休克蛋白(HSPs)是哺乳动物胚胎发育过程中最先产生的蛋白质之一，其表达是哺乳动物胚胎发育优化的必要条件[27]。哺乳动物胚胎发育以细胞快速生长和分化为特征，需要表达多种HSPs才能使胚胎发育达到最佳状态[28]。自发的、结构性的HSP70表达开始于合子基因组活动，在2细胞早期，可诱导的HSP70表达和其他类热休克蛋白表达的形成似乎受到发育调控[29]。Rylander等[30]研究表明，在应激源的作用下，哺乳动物胚胎中HSPs的表达升高，且相关蛋白合成及功能减弱。还有研究表明，在囊胚期胚胎中，热休克蛋白Grp78的表达呈现出较高水平，这一点可能与胚胎的生理代谢变化有关，由于哺乳类动物胚胎对培养环境非常敏感，保持稳定的培养条件非常重要[31]。随着胚胎的发育，HSPs表达呈现降低趋势，这可能是因为HSPs增加了胚胎对外环境各种有害刺激应对的敏感性，例如温度升高、氧化应激等[32]。关于水牛胚胎中HSP70基因特征和表达的研究指出，卵母细胞成熟培养及附植前体外胚胎发育时可用HSP70作为生物因素优化胚胎培养条件[33]。还有研究发现，HSP70表达被抑制后可降低囊胚的发育率，证实HSPs在胚胎发育中的表达对胚胎起到了保护作用。研究表明，HSPs的表达量量与动物体胚胎的附植和胚胎毒性有关[34-35]。Walsh等[36]发现，HSP27的上调可能是细胞生长停滞和分化的必要条件。Mehlen等[37]发现，HSP27表达不足导致分化流产，这是由于细胞凋亡导致的整体死亡。Arrigo[38]发现，HSP27的表达与细胞分化和凋亡之间的平衡有关，与细胞增殖阶段无关。本研究发现，牦牛HSP27表达量最高是在体外培养孤雌激活2～4细胞期胚胎中，表达量最低是在囊胚期胚胎中，伴随着胚胎的不断发育，HSP27的表达量逐渐降低，同时在体外培养孤雌激活2～4细胞期胚胎和囊胚期胚胎中的表达差异显著，说明HSP27的表达与胚胎发育有重要联系。以上研究均证实HSP27在卵母细胞成熟和附植前体外胚胎发育过程中有重要的作用。

免疫荧光染色结果表明，HSP27蛋白在牦牛卵母细胞中有表达，同时在体外培养孤雌激活2～4细胞期胚胎、5～8细胞期胚胎和桑椹胚细胞核和细胞质中均有表达，在囊胚期主要在细胞核中表达。有研究表明，HSP27蛋白随着胚胎的不断发育，其表达从细胞质逐渐转移至细胞核，这与本研究结果基本一致，可能是因为HSP27蛋白降低了胚胎细胞核对外界各种有害刺激的敏感性，从而促进了胚胎发育[30]。刘姗[39]研究发现，HSP27表达定位于小鼠早期胚胎发育的不同时期胚胎的细胞核和细胞质内，未在核仁中表达，本试验结果与上述研究一致。综上所述，在哺乳动物牦牛胚胎发育的生理过程中HSP27发挥重要作用。

4 结论

本研究发现HSP27基因在牦牛未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞以及孤雌激活不同时期胚胎中均有表达。免疫荧光染色显示HSP27蛋白在牦牛未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞中有表达，在体外胚胎孤雌激活2～4细胞期胚胎、5～8细胞期胚胎和桑椹胚中主要存在于细胞核内和细胞质中，而在囊胚期主要存在于细胞质中。表明HSP27在牦牛体外早期胚胎的发育具有潜在的调控作用。本研究为进一步明确HSP27在胚胎发育中的作用及机理提供了一定的理论依据。