中波紫外线处理对香菇采后维生素D2含量及生化品质的影响研究

蔡继业 房祥军 韩延超 陈杭君 郜海燕 吴伟杰

(浙江省农业科学院食品科学研究所/农业农村部果品采后处理重点实验室/浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室/中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室，浙江 杭州 310021)

香菇(Lentinusedodes)别名香信、花菇、厚菇、花蕈等，是我国特产的食药兼用型食用菌，是世界第二大食用菌，我国香菇产量占世界80%[1]。香菇富含多糖、嘌呤、核酸、氨基酸以及维生素，具有预防心血管疾病，抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等功能[2-3]。随着生活水平的提高，人们对食品的主观选择性加强，更加注重食品的新鲜、营养与安全性，因此香菇消费将从以往的干香菇向鲜香菇转变。

维生素D2，化学名称麦角钙化甾醇，是人体必需的脂溶性类固醇衍生物，作为钙和磷酸盐代谢的调节物质，对人体健康非常重要[4]。缺乏维生素D2会造成儿童佝偻病和成人骨质疏松等诸多健康问题[5]。维生素D2可通过光化学方式合成，前体物质麦角固醇在紫外光照射下经单重激发态反应生成预维生素D2，再经周环反应生成维生素D2[6]。香菇中含有大量天然麦角固醇，若通过紫外线照射处理，可以获得大量的维生素D2[7]。

紫外线是波长在100～400 nm的紫外光。按波长长短可分为长波紫外线、中波紫外线、短波紫外线。中波紫外线(ultraviolet B irradiation，UV-B)是波长在280～320 nm范围内的紫外光。Zhang等[8]研究发现香菇经UV-B处理后其维生素D2含量显著增加，但脂肪、总糖、蛋白质含量并未发生显著变化。Ryan等[9]也发现双孢蘑菇采后经UV-B处理，维生素D2含量显著上升，而维生素B、维生素C、脂肪酸、氨基酸、叶酸、核黄素、烟酸、泛酸等营养成分含量均无明显变化。

采后的香菇仍是有生命的个体，在外界应激处理后，其生理生化指标会发生系列变化。目前国内外有利用不同处理强化食用菌维生素D2的研究，但基本集中在优化处理温度、时间等工艺条件，从而提高维生素D2的得率[2-4,8]，然而香菇经UV-B处理后生理代谢及抗氧化酶活系统的变化仍鲜有报道。本试验以台农香菇为对象，研究UV-B照射不同时长对香菇维生素D2、色泽、可溶性糖等营养品质与超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)等抗氧化相关酶活以及细胞超微结构的影响，探索UV-B处理提升香菇采后营养品质的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇(L.edodes)台农于2019年10月采于浙江省磐安县浙江盛源食品有限公司。过氧化氢(H2O2)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，南京建成生物工程研究所；维生素D2标准品，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

自制UV-B照射箱，箱顶有UV-B灯3根(UVB-313 EL，南京图特光电科技有限公司，功率15 W，波长313 nm)；YK 35-UV紫外线强度计，路昌LUTRON；CR-400手持色差仪，日本柯尼卡美能达公司；HPLC-2698高效液相色谱仪，美国Waters公司；Agilent Eclipse XDB-C18 4.6 mm×250 mm 色谱柱，美国安捷伦公司；Cintra 20紫外-可见分光光度计，澳大利亚GBC公司；MICCRO 17R台式高速冷冻离心机，美国Thermo公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣公司；877 Titrino plus酸碱自动滴定仪，瑞士万通公司；DK-8D电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；DDS-307电导率仪，上海仪电科学仪器；H7650透射电子显微镜，日本日立股份有限公司；TD2102电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 挑选大小一致、无机械损伤的香菇500 g，单层排列放置于辐照强度为0.203 mW·cm-2的UV-B灯下处理。在室温下正反面分别照射0.5、1、2、3和4 h，处理结束后立即取出测定色泽、可滴定酸、相对电导率，并制备透射电镜观察样品，其余香菇切块，并用液氮研磨成粉后放于-80℃冰箱保存，用于测定其他指标。以未经UV-B灯照射处理的香菇作为对照(CK)，每个处理设置3个重复。取2 h UV-B处理的香菇分装于4 mm PE袋挽口放于4℃冷库，分别于1、3、5 d取样，测定色泽L*值，其余香菇切块，并用液氮研磨成粉后放于-80℃冰箱保存，用于测定维生素D2、游离氨基酸和核苷酸含量。

1.3.2 维生素D2的测定 制作标准曲线：准确称量维生素D2标准品50 mg，置于50 mL容量瓶中，以无水乙醇定容至50 mL，作为母液，取母液分别配成浓度为2、4、8、25、50、100 μg·mL-1的标准液，高效液相色谱仪进样标准液10 μL，绘制标准曲线。流动相为甲醇∶水(95∶5，v∶v)，二级管陈列检测器检测波长254 nm，流速1 mL·min-1，保留时间16.41 min。维生素D2提取参照Zhang等[8]的方法，进样条件同标准液，根据标准曲线定量。

1.3.3 维生素C的测定 参考曹建康等[10]的方法，称取1.0 g香菇冻样粉，加入5 mL 5%三氯乙酸溶液进行提取。取0.5 mL提取液，依次加入1.5 mL 5% TCA溶液、1 mL无水乙醇、0.5 mL 4%磷酸-乙醇溶液、1 mL 5%邻菲罗琳-乙醇溶液、0.5 mL 0.03%三氯化铁-乙醇溶液，在30℃条件下反应60 min，在534 nm波长处测定吸光值，根据标准曲线计算维生素C的含量。

1.3.4 色泽的测定 参照Jiang等[11]的方法并稍做修改。将手持色差仪用白板进行校准后，对每组香菇盖进行L*、a*和b*值的测定，每组记录5个点，取平均值，以未处理香菇色泽值为理想色泽。根据公式计算总色差值(ΔE)：

(1)

式中，L*、a*、b*为处理组的明度、红绿度、黄蓝度；L0、a0、b0为理想香菇的明度、红绿度、黄蓝度，L0=97，a0=-2，b0=0。

1.3.5 可溶性糖的测定 参考曹建康等[10]的方法，采用蒽酮-比色法进行可溶性糖含量测定。准确称取1.0 g香菇粉置于50 mL三角瓶，加入15 mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min(提取2次)，冷却后过滤至50 mL容量瓶，吸取样品提取液0.5 mL于20 mL具塞试管中，加1.5 mL蒸馏水、0.5 mL蒽酮-乙酸乙酯、5 mL浓硫酸，沸水中保温1 min，取出冷却，以蒸馏水做参比调零，于630 nm波长处测定吸光度，按照标准曲线计算香菇中可溶性糖的含量。

1.3.6 可滴定酸的测定 随机选取5个香菇，用干净的纱布包裹后挤压出汁，吸取1 mL香菇汁液于100 mL容量瓶定容至100 mL，使用碱滴定法，以酸碱自动滴定仪滴定，滴定pH值至8.2，结果以结晶柠檬酸百分比表示。

1.3.7 游离氨基酸含量测定 采用茚三酮比色法[12]测定，称取0.5 g香菇粉加入50 mL蒸馏水后煮沸15 min，过滤，收集滤液定容到250 mL。取1 mL待测液，加入3 mL蒸馏水、1 mL磷酸缓冲液(pH值8.0)和1 mL的1.2%茚三酮溶液，混匀后沸水浴15 min显色，取出冷却至室温后定容至25 mL具塞试管，于570 nm处测定吸光值。以亮氨酸为标准物质制作标准曲线，计算游离氨基酸含量。

1.3.8 呈味核苷酸含量测定 参考秦苏怡[13]的方法，准确称取1.0 g香菇粉，加入蒸馏水25 mL，70℃水浴2 h，4 500 r·min-1离心10 min，取上清液，以0.01 mol·L-1盐酸为参比溶液，测定吸光值。以呈味核苷酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标制作标准曲线。

1.3.10 过氧化氢含量的测定 称取香菇粉0.1 g，加入0.9 mL生理盐水，冰浴条件下，制备成10%匀浆液，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，根据试剂盒说明书在405 nm波长处进行测定。

1.3.11 丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的测定 采用分光光度计法[14]测定MDA含量。称取0.5 g香菇粉，加5 mL 5%的三氯乙酸，5 000 r·min-1、4℃离心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL 0.67% 的硫代巴比妥酸溶液，混合后在100℃水浴煮沸30 min，冷却后再离心一次，收集上清液分别测定其在450、532和600 nm波长处的吸光度值。

1.3.12 相对电导率的测定 采用电导率法[15]并略做修改，取香菇盖用手术刀片切取1 mm厚薄香菇片，准确称取2.0 g放入盛有20 mL去离子水的50 mL离心管中，立即用电导率仪测定其电导率，记为P0，20 min后测其电导率为P1，将溶液煮沸10 min，冷却至室温，加水至刻度，测其电导率为P2。

(2)。

1.3.13 酶活性测定 CAT活性测定：称取香菇粉0.1 g，加入0.9 mL生理盐水，冰浴条件下，制备成10%匀浆液，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，之后根据试剂盒说明书进行测定。

POD活性测定：采用愈创木酚法[10]测定样品的POD活性，略做修改。称取0.2 g香菇粉，加入1 mL 0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液(pH值6.8)，在4℃条件下10 000 r·min-1离心30 min，收集上清液。取0.4 mL上清液，加入0.2 mL 6 mmol·L-1愈创木酚，2.4 mL 5 mmol·L-1的过氧化氢于20 mL具塞试管，混匀，在470 nm波长处测定吸光值在3 min内的变化。以蒸馏水为参比，每分钟470 nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位，结果以U·g-1表示。

SOD活性测定：称取0.5 g香菇粉，加入0.1 mol·L-1pH值6.8的磷酸盐缓冲液2 mL，冰水浴条件下进行匀浆，制备20%匀浆液，然后在4℃条件下10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，根据试剂盒说明书进行测定。

脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)活性测定：参考Wang等[16]的方法测定样品的LOX活性，略做修改。称取0.2 g香菇粉，加入1 mL已预冷的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(pH值6.8)，在4℃、10 000 r·min-1条件下离心30 min，收集上清液，备用。取2.7 mL磷酸缓冲液(pH 值6.8)，0.2 mL 0.5%亚油酸溶液，0.1 mL提取液于20 mL具塞试管，混匀，在234 nm波长处测定吸光值，每隔15 s记录1次，连续测定，记录6个点数据，计算酶活性，以234 nm波长下每分钟增加0.01个吸光度为一个酶活单位，结果以U·g-1表示。

1.3.14 超微结构观察 取香菇菌盖切成1 mm×3 mm薄片，浸泡于2.5%戊二醛溶液4℃条件下固定过夜，磷酸缓冲液(0.1 mol·L-1，pH 值7.0)漂洗15 min后用1%的锇酸溶液固定2 h，之后再用50%、70%、80%、90%、95%和100%浓度乙醇梯度脱水直至脱水剂完全挥发，样品包埋于Spurr包埋剂中过夜，使用超薄切片机将组织样品切至90 nm，利用透射电镜(transmission electron microscope，TEM)分析细胞内的结构变化。

1.4 数据分析

采用Excel 2010软件进行数据统计、Origin 2017进行数据图表制作，SPSS 22.0软件进行数据差异显著性分析(显著水平为0.05)。除特殊说明外，所有数据均为3次重复试验的平均值和标准差。

2 结果与分析

2.1 UV-B处理对香菇维生素D2和维生素C含量的影响

由图1-A可知，CK组香菇未检出维生素D2，随着照射时间的延长，香菇维生素D2含量呈上升趋势，UV-B照射0.5 h，香菇维生素D2含量显著高于CK组(P<0.05)，UV-B照射3 h组香菇中的维生素D2含量最高，为108.18 μg·g-1，表明UV-B处理能增加香菇中维生素D2的含量，但照射时间超过3 h后维生素D2含量增加不明显，这可能是由于UV-B对香菇盖的穿透力有限，不能与香菇盖深处的麦角固醇发生反应，因此当维生素D2增加到一定程度后反应会受到限制，含量逐渐趋于稳定[17]。

由图1-B可知，经UV-B处理，香菇中维生素C的含量先升高再降低，UV-B照射2 h时香菇中维生素C的含量最高，为46.1 μg·g-1，高于CK，是CK的1.16倍，继续延长UV-B照射时间，香菇维生素C含量下降，与CK组无显著差异。说明适当的UV-B照射时长可促使香菇维生素C含量的增加。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Note:Different lowercase letters indicate significantly differences at 0.05 level.The same as following.图1 不同UV-B照射时间对香菇维生素D2和维生素C含量的影响Fig.1 Effects of different UV-B exposure times on vitamin D2 and vitamin C contents in Lentinus edodes

2.2 UV-B处理对香菇色泽的影响

由表1可知，各组香菇的L*值在35～41之间，说明香菇的亮暗程度存在差异;且随着UV-B照射时间的延长，香菇ΔE值随之增加，当照射时长大于0.5 h时，香菇ΔE值显著高于CK(P<0.05)，香菇的a*值和b*值分别在UV-B处理3 h和4 h与CK存在显著差异(P<0.05)。由图2可知，香菇盖正面在0～4 h内，由黄褐色逐渐褐变，并且表面出现开裂痕迹，香菇褶褐变程度加深。说明UV-B长时间照射可使香菇褐变，且长时间会灼伤香菇表面。

表1 不同UV-B照射时间对香菇色泽的影响Table 1 Effects of different UV-B irradiation time on color of Lentinus edodes

Note：A1,A2：0 h.B1,B2：0.5 h.C1,C2：1 h.D1,D2：2 h.E1,E2：3 h.F1,F2：4 h.图2 不同UV-B照射时间对香菇色泽的影响Fig.2 Effects of different UV-B irradiation time on color of Lentinus edodes

2.3 UV-B处理对香菇可溶性糖和可滴定酸含量的影响

糖是果蔬组织中重要的能量贮藏物质，糖的代谢降解是引起食用菌腐败变质的重要原因[18]。由图3-A可知，香菇在不同UV-B照射时间处理过程中，随着照射时间延长，呈先上升后下降趋势，1 h后含量虽低于CK组，但差异不大。由图3-B可知，香菇可滴定酸含量在UV-B照射前3 h内无显著变化，4 h时显著上升，可能是长时间UV-B照射加深了香菇的衰老程度，从而造成有机酸含量上升,过量的UV-B处理会促使香菇有机酸的积累[19]。

图3 不同UV-B照射时间对香菇可溶性糖和可滴定酸含量的影响Fig.3 Effects of different UV-B irradiation time on the soluble sugar and titratable acid contents of Lentinus edodes

2.4 UV-B处理对香菇滋味物质的影响

游离氨基酸和呈味核苷酸是香菇中非挥发性风味物质的重要成分[20]，是香菇主要的滋味来源物质。由图4-A可知，香菇中游离氨基酸含量在不同UV-B照射时间内无显著差异。由图4-B可知，UV-B照射3 h内对香菇呈味核苷酸含量无负面影响，处理时间超过4 h会使核苷酸含量降低。

图4 不同UV-B照射时间对香菇滋味物质含量的影响Fig.4 Effects of different UV-B irradiation time on the flavor content of Lentinus edodes

2.5 UV-B处理对香菇活性氧代谢和膜脂过氧化的影响

图5 不同UV-B照射时间对活性氧代谢和膜脂过氧化影响Fig.5 Effects of different UV-B irradiation time on reactive oxygen metabolism and membrane lipid peroxidation

MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一，通常作为脂质过氧化的指标，反映细胞膜脂过氧化程度。由图5-C可知，UV-B处理组香菇中MDA含量均显著高于CK(P<0.05)，UV-B照射4 h时最高，为CK组的1.41倍。细胞膜具有一定的通透性，受到破坏后，膜通透性不断增加，会导致细胞液渗透到细胞外，使组织失水，加快果实衰老[22]。相对电导率可反映细胞组织的完整性和损伤程度。由图5-D可知，UV-B处理组香菇的相对电导率均高于CK组，从UV-B照射1 h开始，香菇的相对电导率显著高于CK(P<0.05)。从3 h开始相对电导率急剧上升，照射4 h时相对电导率最大，为CK组的2.87倍，表明细胞膜损伤较为严重，表明过量UV-B照射处理使香菇细胞膜透性增加，组织破坏程度加深，在一定程度上加速了细胞的衰老进程。

2.6 UV-B处理对香菇抗氧化相关酶的影响

由图6-A、B、C可看出，在本研究中香菇CAT、SOD、POD活性在整个过程中均保持较高，且呈上升趋势。与CK组相比，UV-B照射4 h后香菇的CAT活性提高了8.41%，SOD活性提高15.27%，POD活性提高32.69%，说明UV-B胁迫可诱导香菇体内CAT、POD、SOD活性的上升，从而清除体内自由基，维持抗氧化系统正常代谢。如图6-D所示，香菇在UV-B照射期间LOX活性呈缓慢上升趋势，UV-B照射2、3 和4 h时香菇的LOX活性显著高于CK(P<0.05)，0.5、1、2、3和4 h处理组的LOX活性分别是对照组的1.03、1.08、1.14、1.13和1.14倍。综合MDA的结果可以看出LOX的变化趋势与MDA含量变化呈正相关，表明UV-B处理加重了香菇膜脂过氧化程度。

图6 不同UV-B照射时间对香菇活性氧代谢相关酶影响Fig.6 Effects of different UV-B irradiation times on the enzymes related to active oxygen metabolism of Lentinus edodes

2.7 UV-B处理对香菇超微结构的影响

透射电镜可观察到物理处理对果蔬超微结构的影响，直观地反映细胞内部的结构与形态变化，辅助说明物理处理对果蔬的品质影响[23]。由图7-A、B可知，CK和UV-B照射2 h时香菇菌盖细胞内部细胞器清晰，两者胞质都很均匀，无异常现象。UV-B照射4 h时，香菇细胞器发生破损，胞质消融，细胞核自溶降解严重(图7-C)，观察结果可辅助说明2 h的UV-B处理尚未对香菇的细胞结构产生明显影响，但处理4 h后会显著损伤细胞，加速细胞的降解。该结果与图5-D相对电导率上升所反映出的膜通透性增加，电解质外渗严重，细胞组织受到破坏的结果一致。

图7 不同UV-B照射时间对香菇超微结构影响Fig.7 Effects of different UV-B irradiation time on ultrastructure of Lentinus edodes

2.8 UV-B处理对香菇贮藏品质的影响

由图8-A可知，在贮藏过程中香菇L*值呈下降趋势，说明香菇出现褐变。UV-B处理2 h后香菇盖L*值为38.34，低于贮藏0 d时的L*值(40.45)，表明香菇已发生褐变，并且褐变程度随贮藏时间延长不断加深。贮藏5 d时香菇L*值为36.71，是CK组的90.75%，二者无显著差异(P>0.05)。由图8-B可知，CK香菇维生素D2含量过低未能检测到，UV-B处理组维生素D2初始含量为104.87 μg·g-1，贮藏期间呈现下降趋势，贮藏1 和3 d的含量分别是初始值的90.61%和78.39%，5 d时其含量依然保持在81.12 μg·g-1，为初始值的77.28%，说明UV-B照射处理后维生素D2在短期贮藏期内依然大量存在。Kalaras等[24]研究表明经过脉冲紫外处理后，双孢蘑菇中的维生素D2的含量大幅增加，且在3℃低温贮藏11 d后维生素D2的含量仍然能保持在较高水平，这与本研究结果一致。食用菌中蛋白质和多肽在蛋白酶的作用下会发生降解，产生游离氨基酸，贮藏过程中游离氨基酸的含量呈上升趋势[25]。由图8-C可知，贮藏初期(0 d)CK组香菇中游离氨基酸含量为2.55 mg·g-1，UV-B处理组为2.57 mg·g-1；贮藏末期(5 d)CK组香菇游离氨基酸含量为3.17 mg·g-1，处理组为3.23 mg·g-1，两者之间无显著差异(P>0.05)。食用菌中的核苷酸含量随着成熟度增加，在贮藏期间呈上升趋势[26]。由图8-D可知，贮藏5 d后CK与处理组香菇中呈味核苷酸的含量分别为0 d时的1.09倍和1.15倍，两者间无显著差异。综上，UV-B照射处理显著增加了鲜香菇中维生素D2含量，且在贮藏过程中能保持较好的稳定性。此外，UV-B处理对香菇在贮藏过程中的色泽、营养品质等含量无显著影响。

图8 UV-B照射对香菇贮藏品质的影响Fig.8 Effects of UV-B irradiation on storage qualities of Lentinus edodes

3 讨论

鲜香菇富含麦角固醇，经UV-B处理后可转化为维生素D2。本研究利用0.203 mW·cm-2的UV-B处理香菇，发现0.5 h的照射处理能显著增加香菇中维生素D2的含量。Huang等[27]发现用UV-B照射黄金平菇、粉平菇、平菇2 h后，3种平菇子实体中维生素D2的含量均显著增加。香菇在采后仍是有生命的个体，在正常环境下酚类物质的水平与香菇的褐变程度密切相关。当香菇组织受到破坏时，液泡内的酚类化合物大量释放，加速褐变[28]。孙梦姣等[29]用UV-C照射双孢蘑菇，照射时间超过30 min后色泽加深。本研究也得到类似结论，可能是香菇为了抵御UV-B辐射，合成了更多可吸收UV-B辐射的色素，在长时间的UV-B照射下，香菇细胞膜结构会发生改变或遭到破坏，促使酚类与酶接触，在氧气的作用下，导致香菇褐变程度增加。

4 结论

本研究发现适量的UV-B处理可强化香菇中维生素D2、维生素C含量和抗氧化系统，且对其他营养品质指标如可溶性糖、有机酸、游离氨基酸、核苷酸等均无显著影响。过量的UV-B照射会对香菇细胞造成损伤，照射后期，香菇色泽加深、细胞膜完整性被破坏，细胞器逐渐降解，加速衰老。综上，2 h的UV-B照射(0.203 mW·cm-2)处理有利于香菇维生素D2的强化，并且对其他营养品质指标无显著负面影响，在后期贮藏过程中发现香菇中经UV-B强化后维生素D2可保持较好稳定性，且对其外观和滋味品质无显著影响。本研究为延长香菇维生素D2含量并延长其货架期提供了理论指导。