复合酶水酶法提取鹿油及其脂肪酸组成分析

夏蕴实，刘畅，王梓，孙印石*

1. 中国农业科学院特产研究所（长春 130000）；2. 吉林农业大学中药材学院（长春 130000）；3. 长春大学食品学院（长春 130000）

我国是世界上梅花鹿养殖历史最悠久的国家，是世界三大养鹿国（新西兰、中国、俄罗斯）之一[1]。鹿油是鹿科动物梅花鹿（Cervus nippon）或马鹿（Cervus elaphus）的脂肪油，也叫鹿脂，是一种资源丰富的鹿副产品，具有较高的可利用价值。鹿油的提取方式主要有熬制法[2]、超临界二氧化碳萃取法[3]和水酶法。熬制法因提取温度较高且不易控制火候，容易出现焦糊，对鹿油中有效成分也有一定影响，影响油脂品质；超临界二氧化碳提取法工艺繁琐且费用较高，导致所提油脂价格昂贵。

水酶法的作用原理是采用相关的酶（如淀粉酶、蛋白酶、果胶酶等）在水相中降解油料细胞壁、分解油料细胞与其他大分子形成的复合物，使油脂从油料中释放出来，并利用油和水密度不同，通过离心将非油成分和油分离[5]，具有绿色环保、反应条件温和、安全等优点[4]。近年来，水酶法被广泛应用于动物油脂的提取中。吴详庭[6]以水酶法提取鲐鱼油，在酶量1 000 U/g原料，pH 7.3，45 ℃条件下提取率达78.66%，且以该法提取油脂可有效降低乳化，提高油脂提取率，操作方法简单高效，价格低廉，便于商业化生产。王庆玲等[7]首次利用水提法提取猪油并比较4种蛋白酶对提油率的影响，结果表明，碱性蛋白酶所提猪油提取率最高，可达96.82%。由于水酶法提取温度较低，与传统提油方法相比，所得猪油的基本理化指标结果均优。

有研究使用单一的木瓜蛋白酶提取鹿油，提取率较低，为73.7%±0.4%[8]。为有效提高鹿油提取率，试验以鹿板油为原料，采用复合酶水酶法提取鹿油，考察提取条件对鹿油提取率的影响，采用单因素试验和正交试验优化提取鹿油的工艺条件，利用GC-MS（气相色谱-质谱联用仪）对鹿油的脂肪酸组成进行分析与鉴定，为鹿油的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鹿油（未经加工的新鲜梅花鹿板油，长春市世鹿鹿业有限公司）；中性蛋白酶（50 000 U/g，Solarbio）；碱性蛋白酶（200 000 U/g，Solarbio）；氢氧化钠、甲醇、无水硫酸钠、氯化钙（北京化工厂）。

1.2 仪器与设备

ME2002/02型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；HH-4A型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；DZF-6090型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；TG16-WS台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；7890A/7000B气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 水酶法提取鹿油

取200 g清洗、沥干水分后的冷冻鹿板油，切碎成小块，按料液比1∶1（g/mL）加入蒸馏水，调节pH，加入一定量的酶，在一定温度下缓慢搅拌一定时间，反应完成后在90～95 ℃下水浴10 min灭酶活，在5 000 r/min条件下离心20 min，吸取上层油，真空干燥，得鹿油。做3组平行试验。

1.3.2 提取率计算

1.3.3 单因素试验

在确定料液比基础上，以鹿油提取率为指标，分别以复合酶配比、酶解温度、提取时间、pH和加酶量为变量进行单因素试验。

1.3.4 正交优化试验

在单因素试验基础上，以鹿油提取率为指标，选择复合酶配比、酶解温度、提取时间、pH和加酶量为考察因素，按L9(34)正交因素水平表进行正交试验。

1.3.5 理化指标

水分测定按GB 5009.3—2016进行测定；酸价按GB 5009.229—2016进行测定；过氧化值按GB 5009.227—2016进行测定。

1.3.6 脂肪酸组成分析

1.3.6.1 甲酯化处理

称取150 mg鹿油，加入8 mL 2% NaOH-甲醇溶液，于80±1 ℃回流，直至油滴消失，冷却至室温，加入7 mL 15% BF3-甲醇溶液，于80±1 ℃回流3 min，取出，迅速冷却至室温。准确加入15 mL正庚烷，涡旋2 min，加饱和NaCl水溶液，静置分层。吸取约5 mL上层正庚烷液至装有3～5 g无水硫酸钠的50 mL离心管中，涡旋1 min，离心，上清液稀释10倍或100倍进样。

1.3.6.2 气质联用仪条件

色谱柱，DB-23 60 m×0.25 mm×0.25 μm；载气，高纯He；载气流量1.0 mL/min；进样口220 ℃；EI源230 ℃。程序升温条件：初始温度60 ℃，保持1 min，10 ℃/min，升温至180 ℃，以3 ℃/min升温至220 ℃，保持2 min。

1.4 统计学分析

用S P S S 统计分析软件进行单因素方差分析（ANOVE），Duncan法进行多因子比较分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 复合酶配比对鹿油提取率的影响

在料液比1∶1（g/mL），酶解温度50 ℃，加酶量1%，pH 7.0，酶解时间1 h条件下，研究复合酶配比对鹿油提取率的影响，结果见图1。复合酶提取率均高于单一酶提取率，可能是由于复合酶使酶解更加完全。随着酸性蛋白酶添加比例降低、碱性蛋白酶添加比例升高，鹿油提取率升高，中性蛋白酶与碱性蛋白酶1∶3时，鹿油提取率达到最高，为83.6%。进一步升高碱性蛋白酶比例，提取率反而降低，可能是由于过度的碱性蛋白酶的添加阻碍了酶解反应的进行。后续试验以复合酶配比（中性蛋白酶∶碱性蛋白酶）1∶3进行。

图1 复合酶配比（中性蛋白酶∶碱性蛋白酶）对鹿油提取率的影响

2.1.2 酶解温度对鹿油提取率的影响

在料液比1∶1（g/mL），加酶量1%，pH 7.0，酶解时间1 h，复合酶配比1∶3条件下，酶解温度为35～60 ℃时，研究不同酶解温度对鹿油提取率的影响，结果见图2。温度35～55 ℃时，随着温度升高，提取率逐渐升高；55 ℃时提取率最高，为85.6%；温度超过55℃时，提取率逐渐下降。因此，55 ℃为复合酶解最适温度，温度升高和降低都会抑制复合酶活性，进而影响鹿油提取率[9-10]。后续试验以酶解温度55 ℃进行。

图2 酶解温度对鹿油提取率的影响

2.1.3 酶解时间对鹿油提取率的影响

在料液比1∶1（g/mL），酶解温度55 ℃，加酶量1%，pH 7.0，复合酶配比1∶3，酶解时间0.5～3.5 h条件下，研究不同酶解时间对鹿油提取率的影响，结果见图3。酶解时间0.5～2.5 h时，鹿油提取率随着酶解时间的增加而升高，酶解时间超过2.5 h时，鹿油提取率逐渐趋于平缓。其中，酶解时间1.0～2.5 h时，复合酶反应速率较快，2.5 h后底物反应近乎完全，且产物抑制等作用导致反应速率降低[11-13]。因此最适提取时间为2.5 h，提取率为84.4%。后续试验以酶解时间2.5 h继续进行。

图3 酶解时间对鹿油提取率的影响

2.1.4 加酶量对鹿油提取率的影响

在料液比1∶1（g/mL），酶解温度55 ℃，pH 7.0，酶解时间2.5 h，复合酶配比1∶3，加酶量0.5%～4%条件下，研究不同加酶量对鹿油提取率的影响，结果见图4。加酶量＜2.0%时，随着加酶量增加，鹿油提取率逐渐升高，加酶量2%时达到最高，为87.5%。加酶量＞2.0%时，鹿油提取率降低，原因可能是复合酶浓度超过一定量时，酶和底物不能充分接触，导致酶促反应效率下降[14]，因此后续试验以加酶量2%进行。

图4 复合酶添加量对鹿油提取率的影响

2.1.5 pH对鹿油提取率的影响

在料液比1∶1（g/mL），酶解温度55 ℃，加酶量2%，酶解时间2.5 h，复合酶比1∶3，pH 4.5～8.0条件下，研究不同pH对鹿油提取率的影响，结果见图5。pH＜ 7.0时，鹿油提取率随着pH的升高而升高，pH＞7时，鹿油提取率随着pH升高而降低；pH 7.0时，鹿油提取率达到最高，为78.8%。这可能与蛋白酶的底物适应性有关[15]。因此，复合酶解最适pH为7.0。

图5 pH对鹿油提取率的影响

2.2 正交试验

在单因素试验的基础上，根据正交试验设计方案，选取复合酶配比、酶解温度、加酶量和酶解时间为自变量，以鹿油提取率为指标，设计L9(34)正交试验。正交试验因素水平见表1，正交试验设计及结果见表2。

表1 正交因素水平

由表2中极差值R可知，4个影响因素对鹿油提取率影响程度大小依次是B＞D＞A＞C。所得最优方案为B2D2A2C2，即酶解温度55 ℃、pH 7.0、复合酶配比1∶3、加酶量2%。

表2 正交试验结果

2.3 验证试验

按照上述最优条件，完成3组平行试验进行验证，所得提取率分别为84.3%，86.1%和85.7%，3组结果无显著差异。由此可知，试验优化的提取工艺具有良好的稳定性和重现性。

2.4 最佳条件下所提鹿油的理化指标

由表3可知：最佳提取条件下所得鹿油含水量为6.25%，水酶法提取油脂中通常含有较多水分，高速离心并不能完全去除油脂中的水分，通常需要通过直接干燥法或减压干燥法去除多余水分；最佳提取条件下所得鹿油的酸价为2.27 mg/g，低于《食品安全国家标准食用动物油脂》所规定的酸价≤2.50；过氧化值为0.26 g/100 g，稍高于过氧化值≤0.20，可能是由于存放时间过长或存放过程中接触到空气、阳光，使所提鹿油过氧化值略有升高[16]。

表3 鹿油的理化指标

2.5 鹿油脂肪酸组成分析

采用GC-MS对甲酯化衍生的鹿油脂肪酸组成进行分析，其总离子流色谱图见图6。通过标准品对照和数据库检索对其脂肪酸进行定性，并按峰面积归一化法进行定量，分析结果见表4。

图6 鹿油脂肪酸甲酯气相色谱图

由表4可知，通过外标法在复合酶水酶法提取的鹿油中共检测出20种脂肪酸。其中，含量大于5%的脂肪酸共5种，依次是棕榈酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1n9C）、棕榈油酸（C16∶1n7）、亚油酸（C18∶2n6）。饱和脂肪酸9种，主要包括棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸等，占脂肪酸总量的64.60%；单不饱和脂肪酸4种，包括油酸、棕榈油酸等，占脂肪酸总量的28.56%；多不饱和脂肪酸7种，包括亚油酸、亚麻酸等，占脂肪酸总量的6.62%。

表4 鹿油中脂肪酸组成及含量

棕榈酸又称软脂酸，其钠盐是肥皂的主要成分之一，在工业上通常由动植物油脂皂化制得，且被广泛应用于润滑剂、涂料、油墨和增塑剂中。硬脂酸主要用于生产硬脂酸盐，在食品工业、化妆品工业及橡胶工业均有广泛应用[17]。油酸、棕榈油酸、亚油酸是不饱和脂肪酸，能够降低血液黏稠度、改善血液微循环、保持细胞膜的相对流动性，以保证细胞的正常生理功能，部分不饱和脂肪酸还具有免疫调节和调节血脂等作用，如亚油酸[18-20]。

3 结论

采用正交试验的方法优化复合蛋白酶水酶法提取鹿油的工艺，各因素对鹿油提取率影响的大小依次为B＞D＞A＞C，所得最佳工艺参数：料液比1∶1（g/mL），酶解温度55 ℃、pH 7.0、复合酶配比1∶3、加酶量2%。在此条件下，鹿油提取率为85.37%。采用GC-MS对复合酶水酶法提取的鹿油成分进行分析鉴定，共鉴定出20种化合物，主要含有棕榈酸、硬脂酸、油酸、棕榈油酸、亚油酸等，其中不饱和脂肪酸占64.60%，单不饱和脂肪酸占28.56%，多不饱和脂肪酸占6.62%。水酶法是一种简单、温和且无污染的提取油脂方法，复合酶提取鹿油较单一酶提取更为完全，明显提高鹿油提取率，具有潜在应用前景。