高温蒸煮碱法预处理玉米芯酶法制备低聚木糖

张智超，郭弯弯，孙军涛*

许昌学院（许昌 461000）

低聚木糖是由2～9个木糖单元以β-1, 4糖苷键连接而成的低聚糖混合物[1]。低聚木糖具有较高的耐热和耐酸性能，在pH 2.5～8.0范围内100 ℃加热1 h几乎不分解，是双歧杆菌增殖所需用量最小的低聚糖[2]，具有改善人体肠道、抗龋齿、提高免疫机能、促进钙的吸收、改善脂质代谢等功能[3-6]。

玉米芯是制备低聚木糖的主要原材料之一[7]，2020年我国玉米总产量约2.76亿 t，大约有0.88亿 t的玉米芯副产物，为低聚木糖的制备提供了丰富的原料资源。目前绝大部分玉米芯作为农家燃料被烧掉，以玉米芯为原料制备低聚木糖，不仅可以综合利用农产品资源、保护环境，同时也可以增加农民收入，具有很好的经济效益和社会效益[8-9]。试验将粉碎后的玉米芯，先经过高温蒸煮碱法预处理，然后用木聚糖酶水解制备低聚木糖，为玉米芯制备功能性低聚木糖生产提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米芯（河南省濮阳市）；木聚糖酶（江苏锐阳生物科技有限公司）；3, 5-二硝基水杨酸（上海科丰化学试剂有限公司）；木糖（上海迈坤化工有限公司）；活性炭（天津科密欧化学试剂有限公司）；无水乙醇（天津大茂化学试剂厂）；其余试剂均为国产分析纯。

FA2104B分析天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；LabTech紫外可见分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司）；HZQ-X100A恒温振荡培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；TDL-60B低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；BPG-9200AH电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；PHS-3C pH计（上海仪佑科仪器仪表有限公司）；FW-100万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.2 测定方法

1.2.1 还原糖的测定

还原糖的测定采用DNS法[10]。

1.2.2 可溶性总糖测定

向待测液中加入终质量浓度为72 g/L的浓硫酸，沸水浴2 h，然后用6 mol/L的氢氧化钠溶液中和至中性，按还原糖的测定方法测定待测液中可溶性总糖的含量。

1.2.3 平均聚合度（DP）的计算

1.3 玉米芯高温蒸煮碱法预处理

分别选择料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30和1∶35 g/mL）、碱浓度（0.4，0.7，1.0，1.3和1.6 mol/L）、温度（90，100，110，120和125 ℃）和时间（20，30，40，50和60 min）为主要因素，通过测定预处理溶液中总糖和还原糖含量，确定玉米芯高温蒸煮碱法预处理工艺条件。

1.4 木聚糖酶制备玉米芯低聚木糖

分别选择木聚糖酶添加量（3%，4%，5%，6%和7%）、pH（3.0，4.0，5.0，6.0和7.0）、酶解温度（40，45，50，55和60 ℃）、酶解时间（10，20，30，40和50 min）为影响因素，以酶解液中还原糖含量、可溶性总糖含量以及平均聚合度为指标，研究各因素对制备低聚木糖的影响。在单因素试验的基础上，选取酶添加量、pH、酶解温度、酶解时间四个因素中的三水平进行L9(34)的正交试验，以还原糖含量为指标，确定最佳制备工艺。

2 结果与分析

2.1 玉米芯高温蒸煮碱法预处理

2.1.1 料液比对玉米芯预处理的影响

高温蒸煮碱法预处理料液比对玉米芯料液中糖含量的影响如图1所示。随着料液比的升高，还原糖含量呈现先升高后降低的趋势，总糖含量呈现先下降再上升后下降的趋势。碱液量少时，玉米芯物料无法充分吸水溶胀，导致糖不能充分溶出，因此糖浓度较低。当碱液增加到一定体积时，稀释作用导致预处理溶液中糖浓度降低[11]。当料液比为1∶25（g/mL）时，预处理的玉米芯料液中的还原糖含量最高，为7.92 mg/L，此时总糖含量为29.47 mg/L。

图1 料液比对玉米芯预处理的影响

2.1.2 碱浓度对玉米芯预处理的影响

高温蒸煮碱法预处理碱浓度对玉米芯料液中糖含量的影响如图2所示。随着碱浓度的增加，预处理溶液中还原糖和总糖含量呈先升高后降低的趋势。碱浓度的增加破坏了玉米芯中半纤维素、纤维素和木质素间的结合，使纤维素、半纤维素游离出来，提高了溶液中糖含量[12]；碱浓度过高，可能导致糖的降解，引起糖含量降低。当碱浓度为1.0 mol/L时，预处理料液中总糖含量最高，为64 mg/L，此时还原糖含量为22.40 mg/L。当碱液浓度高于1.0 mol/L时，总糖含量降低。

图2 碱浓度对玉米芯预处理的影响

2.1.3 温度对玉米芯预处理的影响

高温蒸煮碱法预处理温度对玉米芯料液中糖含量的影响如图3所示。随着温度的升高，料液中总糖浓度和还原糖浓度均呈现先升高后降低的趋势。温度过高可能导致提取液中部分糖发生焦糖化反应，使提取液的颜色变深，影响木聚糖的提取率。当预处理温度为110 ℃时，料液中总糖含量和还原糖含量均达到最高，分别为70.29和19.53 mg/L。

图3 温度对玉米芯预处理的影响

2.1.4 时间对玉米芯预处理的影响

高温蒸煮碱法预处理时间对玉米芯料液中糖含量的影响如图4所示。随着高温蒸煮时间的延长，料液中还原糖含量和总糖含量基本处于缓慢升高并趋于稳定状态。当预处理时间为40 min时，总糖含量和还原糖含量基本达到最高，分别为70.04和16.98 mg/L。

图4 时间对玉米芯预处理的影响

玉米芯高温蒸煮碱法预处理工艺：玉米芯与NaOH的料液比1∶25（g/mL），碱浓度1 mol/L，高温蒸煮温度110 ℃，高温蒸煮时间40 min。

2.2 木聚糖酶制备玉米芯低聚木糖

2.2.1 木聚糖酶制备玉米芯低聚木糖单因素试验

2.2.1.1 木聚糖酶添加量对酶解影响

木聚糖酶添加量对酶解的影响如图5所示。随着酶添加量的增加，总糖含量先减少再增加最后减少，还原糖浓度变化基本不大，聚合度先下降后上升最后趋于平衡。酶用量较高时水解液中酶分子数量较高，酶分子与反应底物结合的概率增加，有效提高了酶解生成低聚木糖的量[13]。当酶添加量为6%时，酶解液中总糖的含量最高，为794.80 mg/L，此时还原糖含量为194.27 mg/L。

图5 木聚糖酶添加量对酶解的影响

2.2.1.2 pH对酶解影响

木聚糖酶酶解pH对酶解的影响如图6所示。pH可以通过改变木聚糖酶的构象进而影响酶的活性位点与底物的结合[14]。pH 5.0时，木聚糖酶的活性最高，酶解液中总糖和还原糖含量最高，分别为1 046.55和275.42 mg/L，此时聚合度达到最低；pH高于或低于5.0均会降低木聚糖酶的活性，导致酶解液中总糖和还原糖含量降低。

图6 pH对酶解的影响

2.2.1.3 温度对酶解影响

温度对木聚糖酶水解的影响如图7所示。在一定温度范围内，升高温度可以加快酶解反应速度，当温度超过一定范围后，过高的温度使酶失活，导致酶解反应速度降低[15]。酶解液中总糖含量、还原糖含量和聚合度均是随着酶解温度的升高呈现先升高后降低，当酶解温度为50 ℃时，酶解液中还原糖含量达到最高，为282.74 mg/L，此时总糖含量为983.05 mg/L。

图7 温度对酶解的影响

2.2.1.4 酶解时间对酶解影响

酶解时间对木聚糖酶水解的影响如图8所示。随着酶解时间的延长，酶解液中还原糖和总糖含量缓慢升高并趋于稳定，而聚合度呈现逐渐降低趋势。当酶解时间高于40 min时，酶解液中还原糖含量和总糖含量随着酶解时间的延长趋于稳定。

图8 酶解时间对酶解的影响

2.2.2 木聚糖酶制备玉米芯低聚木糖正交试验

根据单因素试验结果，选择酶添加量、pH、酶解温度和时间四因素进行L9(34)正交试验，正交试验因素水平表和正交试验结果见表1和表2。

表1 因素水平表

由表2可知，各因素对酶法制备低聚木糖的影响程度依次为B＞A＞D＞C，即pH＞酶添加量＞酶解时间＞温度，最佳配方组合为A2B2C3D3，即木聚糖酶的添加量6%、pH 5.0、木聚糖酶水解温度55 ℃、酶解时间50 min。玉米芯高温蒸煮碱法预处理后，在最佳酶解条件下水解，玉米芯酶解液中还原糖含量为287.36 mg/L，酶解产物经过进一步的脱色、醇沉和干燥工艺，制备的低聚木糖粗品得率为16%。

表2 正交试验结果

3 结论

玉米芯高温蒸煮碱法预处理工艺条件为玉米芯与NaOH的料液比1∶25（g/mL），碱浓度1 mol/L，高温蒸煮温度110 ℃，高温蒸煮时间40 min。木聚糖酶制备低聚木糖的工艺条件为木聚糖酶添加量6%，pH 5.0，酶解温度55 ℃，酶解时间50 min。在此条件下，玉米芯酶解液中还原糖含量为287.36 mg/L，酶解液经脱色、醇沉和干燥后低聚木糖粗得率为16%。