秦皮乙素对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制▲

罗祥力 蔡芃夷 唐 文

(1 四川省南充市中心医院妇科，南充市 637000，电子邮箱：tx9u4j@163.com；2 四川省南充卫生学校解剖教研室，南充市 637000)

宫颈癌是威胁女性健康的第三大癌症[1]，目前手术和化疗是其重要治疗手段，但化疗不良反应较大。中药有效成分在抗癌方面具有毒副作用小的优点，且可以预防放疗产生的并发症，从而提高放疗效果[2-3]。秦皮乙素是中药材秦皮的有效活性成分，具有广泛的抗肿瘤活性，可以抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制肿瘤转移等[4]。有研究显示，秦皮乙素能通过抑制p70S6K/4E-BP1信号通路抑制结肠癌HCT116细胞增殖、迁移以及诱导细胞凋亡[5]，还可显著抑制人胃癌SGC-7901细胞生长[6]，并可浓度和时间依赖性抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖，使细胞周期阻滞于S期并诱导细胞凋亡[7]。但秦皮乙素是否对宫颈癌细胞具有抑制作用，其可能的作用机制是什么，目前尚不清楚。有研究报告，猫白血病C亚类病毒受体1反义RNA1(feline leukemia virus subgroup C receptor 1 antisense RNA 1,FLVCR1-AS1)可通过负调控miR-30b-3p促进神经胶质瘤细胞增殖和侵袭[8]；FLVCR1-AS1过表达可促进卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭，并抑制细胞的凋亡[9]；沉默FLVCR1-AS1可抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭，并加速细胞凋亡[10]。但FLVCR1-AS1对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移侵袭的影响如何，目前也尚未清楚。本研究探讨秦皮乙素对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移、侵袭的影响，以及其是否通过FLVCR1-AS1发挥作用。

1 材料与方法

1.1 材料 SiHa细胞(无锡欣润生物科技有限公司，货号：CL1447)；RPMI-1640培养基(上海杰美基因医药科技有限公司，货号：GMS12322.1)；秦皮乙素(上海宝曼生物科技有限公司，货号：D1084)；细胞周期检测试剂盒(哈尔滨新海基因检测有限公司，货号：S0186)；四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试剂盒(北京裕恒丰科技有限公司，货号：8028)；Transwell小室(上海子起生物科技有限公司，货号：3422)、Matrigel(上海善然生物科技有限公司，货号：356234)；RIPA蛋白裂解液(上海贝博生物科技有限公司，货号：BB-3201)；荧光定量PCR试剂盒[科邦兴业(北京)科技有限公司，货号：208054]。上皮型钙黏附蛋白(epithelial cadherin，E-cadherin)、神经型钙黏附蛋白(neural cadherin，N-cadherin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(武汉菲恩生物科技有限公司，货号：FNab10112、FNab05569、FNab03343)；山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶[亚科因(武汉)生物技术有限公司，货号：A21020]。Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司，批号：11668-019)。

1.2 细胞分组与干预 复苏SiHa细胞后，接种于RPMI-1640培养基中，在含5%二氧化碳、37℃的细胞培养箱中培养，待细胞生长至密度为90%左右时，用胰蛋白酶消化并传代。(1)秦皮乙素干预对细胞增殖等指标的影响：取对数生长期的SiHa细胞，胰蛋白酶消化后培养至5×103个/mL的密度，将细胞接种于96孔板，置于37℃培养箱孵育，并分为对照组、秦皮乙素低剂量组、秦皮乙素中剂量组、秦皮乙素高剂量组。对照组不做处理，秦皮乙素低剂量组、秦皮乙素中剂量组、秦皮乙素高剂量组分别加入终浓度为1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L的秦皮乙素处理48 h后检测相关指标。(2)干扰FLVCR1-AS1表达对细胞增殖等指标的影响：取对数生长期的细胞，将其消化后培养至5×103个/mL的密度，将细胞接种于96孔板，置于37℃培养箱孵育，并分为si-NC组、si-FLVCR1-AS1组，分别将si-NC、si-FLVCR1-AS1(购自上海吉玛制药有限公司)转染至SiHa细胞，转染6 h后更换为含血清培养液继续培养48 h，然后收集细胞，检测相关指标。(3)过表达FLVCR1-AS1对秦皮乙素干预后细胞增殖等指标的影响：取对数生长期的细胞，将其消化后培养至5×103个/mL的密度，将细胞接种于96孔板，置于37℃培养箱孵育，并分为秦皮乙素高剂量+pcDNA组、秦皮乙素高剂量+pcDNA-FLVCR1-AS1组，分别将pcDNA、pcDNA-FLVCR1-AS1(购自上海吉玛制药有限公司)转染至SiHa细胞，转染6 h后用终浓度为4 mmol/L的秦皮乙素处理48 h，收集细胞检测相关指标。以上实验均重复3次。

1.3 流式细胞仪检测细胞周期 按照1.2处理细胞后，收集各组细胞制成单细胞悬液，加入预冷的70%乙醇固定，洗涤后加入核糖核酸酶A，37℃水浴30 min，加入碘化丙啶4℃避光30 min，上机检测激发波长为488 nm处的红色荧光，用流式细胞仪(美国Beckman公司，型号：CytoFLEX)和DNA细胞周期分析软件对细胞周期进行检测分析。

1.4 MTT法检测细胞增殖 按照1.2处理细胞后，收集各组细胞，加入20 μL MTT试剂，继续孵育4 h，加入150 μL的二甲基亚砜，振荡反应10 min，使用酶标仪(山东博科仪器公司，型号：BK-EL10C)于490 nm波长处读取吸光度值。

1.5 Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力 (1)细胞迁移实验：按照1.2处理细胞后，收集各组细胞，弃培养液后，Transwell小室上室加入无血清培养的细胞，下室加入含血清培养基，37℃培养24 h，收集并洗涤细胞，4%多聚甲醛固定、结晶紫染色，显微镜(×200)观察并计数随机5个视野的细胞数，取均值。(2)细胞侵袭实验：用Matrigel包被Transwell小室上室，其余步骤与细胞迁移实验相同。

1.6 蛋白质印迹法检测蛋白表达 按照1.2处理细胞后，收集各组细胞，提取细胞总蛋白，定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜，5%的脱脂奶粉室温封闭聚偏二氟乙烯膜1 h，以GAPDH作为内参蛋白，一抗(1 ∶800)4℃孵育聚偏二氟乙烯膜过夜，TBST洗膜3次，5 min/次，再加入二抗(1 ∶1 200)室温孵育聚偏二氟乙烯膜2 h，曝光显影，定影，用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值，以目的条带和GAPDH条带的比值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.7 实时荧光定量PCR法检测FLVCR1-AS1 mRNA的表达水平 按照1.2处理细胞后，收集各组细胞，采用Trizol试剂(索莱宝生物公司，批号：15596-018)提取细胞总RNA，用分光光度计检测RNA浓度及纯度，用PrimeScript逆转录试剂(大连宝生物公司，批号：RR047A)反转录合成cDNA后进行实时荧光定量PCR扩增。反应体系包括cDNA模板1 μL，SYBR green PCR master mix 10 μL，QN ROX Reference Dye 2 μL，上下游引物各1 μL，RNase-Free水5 μL，总体积20 μL。反应条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，目的基因的相对表达量采用2-△△Ct法计算。FLVCR1-AS1上游引物序列：5′-GTGGCTCTCTCGTTCCC-3′，下游引物序列：5′-CCGTCCTTCGGTAGTGTC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3′，下游引物序列：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3′。

1.8 统计学分析 用SPSS 20.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同剂量秦皮乙素对SiHa细胞周期和细胞增殖的影响 与对照组相比，秦皮乙素中、高剂量组SiHa细胞中G0/G1期细胞比例升高，S期细胞比例降低，细胞吸光度值降低(均P<0.05)；且秦皮乙素低、中、高剂量组G0/G1期细胞比例依次升高，S期细胞比例和吸光度值依次降低(均P<0.05)。见表1。

表1 不同剂量秦皮乙素干预后SiHa细胞的周期变化和细胞增殖情况(x±s)

2.2 不同剂量秦皮乙素对SiHa细胞迁移和侵袭能力、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平的影响 与对照组相比，秦皮乙素中、高剂量组SiHa细胞迁移数、侵袭细胞数减少，E-cadherin蛋白相对表达水平升高，N-cadherin蛋白相对表达水平降低(均P<0.05)；且秦皮乙素低、中、高剂量组SiHa细胞迁移数、侵袭细胞数依次减少，E-cadherin蛋白相对表达水平依次升高，N-cadherin蛋白相对表达水平依次降低(均P<0.05)。见图1和表2。

图1 各组E-cadherin和N-cadherin蛋白表达情况

表2 不同剂量秦皮乙素干预后SiHa细胞的迁移、侵袭能力和相关蛋白表达情况(x±s)

2.3 不同剂量秦皮乙素对SiHa细胞FLVCR1-AS1 mRNA表达水平的影响 与对照组相比，秦皮乙素中剂量组、高剂量组SiHa细胞中FLVCR1-AS1 mRNA相对表达水平降低(均P<0.05)；且秦皮乙素低、中、高剂量组SiHa细胞FLVCR1-AS1 mRNA相对表达水平依次降低(均P<0.05)。见表3。

表3 不同剂量秦皮乙素干预后SiHa细胞中的FLVCR1-AS1 mRNA相对表达水平(x±s)

2.4 干扰FLVCR1-AS1表达对SiHa细胞周期、细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响 与si-NC组相比，si-FLVCR1-AS1组FLVCR1-AS1mRNA相对表达水平降低，G0/G1期细胞比例升高，S期细胞比例和细胞吸光度值降低，迁移和侵袭细胞数减少，E-cadherin蛋白相对表达水平升高，N-cadherin蛋白相对表达水平降低(均P<0.05)，见图2、表4和表5。

图2 干扰FLVCR1-AS1对SiHa细胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表达的影响

表4 干扰FLVCR1-AS1表达后SiHa细胞的FLVCR1-AS1 mRNA相对表达水平、周期变化和细胞增殖情况(x±s)

表5 干扰FLVCR1-AS1后SiHa细胞的迁移、侵袭能力及相关蛋白表达情况(x±s)

2.5 过表达FLVCR1-AS1对秦皮乙素处理后SiHa细胞周期、增殖、迁移和侵袭能力的影响 与秦皮乙素高剂量+pcDNA组相比，秦皮乙素高剂量+pcDNA-FLVCR1-AS1组FLVCR1-AS1 mRNA相对表达水平升高，G0/G1期细胞比例降低，S期细胞比例和细胞吸光度值升高，迁移和侵袭细胞数增加，E-cadherin蛋白相对表达水平降低，N-cadherin蛋白相对表达水平升高(均P<0.05)，见图3、表6和表7。

图3 过表达FLVCR1-AS1对秦皮乙素处理后SiHa细胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平的影响

表6 过表达FLVCR1-AS1对秦皮乙素处理后SiHa细胞FLVCR1-AS1 mRNA表达、细胞周期和增殖的影响(x±s)

表7 过表达FLVCR1-AS1对秦皮乙素处理后SiHa细胞的迁移和侵袭能力、相关蛋白表达水平的影响(x±s)

3 讨 论

中医药因其安全、不良反应少等优势逐渐被用于各种肿瘤的治疗，其不仅可缩小病体体积，延长患者生存期，还可以减少患者因手术及放化疗所带来的不良反应，从而改善生存质量[11]。有研究报告，秦皮乙素可通过下调癌基因c-myc、细胞周期性蛋白D1和细胞核因子κB的表达来抑制肺癌细胞的生长[12]；通过抑制Janus 激酶/信号转导和转录激活剂3的激活以抑制喉癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并使细胞周期阻滞于S期[13]；通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期来抑制前列腺癌细胞的存活[14]；可抑制人白血病细胞增殖，并阻滞细胞周期[15]。E-cadherin是一种钙依赖性的跨膜蛋白，参与细胞与细胞间黏附，在维持细胞的极性和完整性等方面起重要的作用。N-cadherin是在神经组织和肌肉组织中表达的跨膜蛋白[16]，在肿瘤形成过程中N-cadherin表达增加有助于细胞迁移[17]。本实验结果显示，经秦皮乙素中、高剂量处理后SiHa细胞中G0/G1期细胞比例升高，S期细胞比例、细胞活性降低，迁移和侵袭细胞数减少，E-cadherin表达水平升高，N-cadherin表达水平降低(P<0.05)，表明一定剂量的秦皮乙素可抑制SiHa细胞增殖、迁移和侵袭能力，且能够阻滞细胞周期，可能具有治疗宫颈癌的作用。

研究表明长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)参与肿瘤进展，lncRNA FLVCR1-AS1通过调控微小RNA 513c促进肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭[18]；而沉默FLVCR1-AS1可抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路的活性从而抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[19]并可通过调控微小RNA 485-5p抑制胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭[20]。本实验结果显示，干扰FLVCR1-AS1表达后，SiHa细胞中G0/G1期细胞比例升高，S期细胞比例、细胞吸光度值降低，迁移和侵袭细胞数减少，E-cadherin蛋白表达水平升高，N-cadherin蛋白表达水平降低，提示干扰FLVCR1-AS1可抑制SiHa细胞增殖、迁移和侵袭能力。而给予中、高剂量的秦皮乙素处理后，SiHa细胞的FLVCR1-AS1 mRNA表达水平降低，且FLVCR1-AS1过表达后，高剂量秦皮乙素抑制SiHa细胞增殖、迁移、侵袭的作用减弱。这提示秦皮乙素可能通过调控FLVCR1-AS1表达而影响SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭。

综上所述，秦皮乙素可能通过下调FLVCR1-AS1基因的表达从而抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭。