机械应力与生物因子在腰椎黄韧带肥厚过程中作用的研究进展▲

梁雄钦 陈 锋 范晓茜 高 森 杨新强 陆佳辰

(广西中医药大学附属瑞康医院脊柱外科，南宁市 530000，电子邮箱：1072273461@qq.com)

【提要】 腰椎椎管狭窄症是下腰痛的主要病因之一，多发于老年患者，而黄韧带肥厚是引起腰椎椎管狭窄症的重要原因。现代医学研究表明，黄韧带肥厚涉及多种生物因子及分子信号通路，但具体机制尚未完全清楚，而机械应力、炎症反应在黄韧带肥厚过程中起至关重要的作用。本文就机械应力及生物因子在黄韧带肥厚过程中的作用做一综述。

一项关于全球疾病经济负担的研究显示，下腰痛的经济负担等级从1990年的第11位上升到2010年的第6位[1]，而腰椎椎管狭窄症是下腰痛的主要病因之一。腰椎椎管狭窄症是指由各种原因引起的纤维组织增生肥厚或骨质增生，导致椎管或神经根管狭窄，刺激或压迫由此通过的脊神经根或马尾神经而出现以间歇性跛行、腰腿疼痛及麻木为主要临床表现的综合征[2]。研究表明，黄韧带肥厚是引起腰椎管狭窄的主要病理生理机制之一[3]。目前已有众多学者对黄韧带增生肥厚的病理生理机制进行了相关的研究，其中以机械应力、局部炎症反应等分子机制及信号通路的研究报告较多，但目前尚未完全清楚其具体的分子信号传导通路及基因调控靶点。本文就机械应力及生物因子在黄韧带肥厚过程中的作用做一综述。

1 黄韧带肥厚的病理特征

正常的黄韧带主要由弹力纤维和胶原纤维构成，其中弹力纤维和胶原纤维分别占80%和20%。弹力纤维排列紧密规则，表面的分支交错形成网状，弹力纤维间一般可见胶原纤维和散在的成纤维细胞[4]。胶原纤维是由胶原蛋白聚集形成，其中以胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白 Ⅲ为主，胶原纤维细且较均匀，总体与弹力纤维平行[5]。影像学上可观察到正常黄韧带厚度为(3.16±0.85)mm，目前大多数学者认为腰椎黄韧带厚度>5 mm即可诊断为黄韧带肥厚[6-7]。黄韧带肥厚的基本病理特征为弹力纤维损失、排列紊乱，并可出现大量胶原纤维增加、堆积，接着大量的胶原纤维代替弹性纤维，或是形成纤维瘢痕，瘢痕组织持续增生后，黄韧带的弹性度下降，最终导致黄韧带肥厚。因此，黄韧带肥厚的本质就是黄韧带组织纤维化的过程。

2 机械应力在黄韧带肥厚中的作用

异常、反复的机械应力是导致黄韧带肥厚的起始原因。早期学者们发现，黄韧带的弹性纤维受到异常牵拉力后会遭受破坏，并且弹性纤维受到破坏后并不能恢复其弹性功能，异常机械应力造成反复的纤维损伤，形成纤维瘢痕或组织纤维化，最终导致黄韧带肥厚[8]。但机械应力是通过哪种生物信号通路而导致黄韧带肥厚目前尚未完全清楚。目前大多数学者认为机械应力刺激作用下引起炎症介质因子、生长因子的增加是引起黄韧带肥厚的机制之一。

研究表明，机械应力会引起黄韧带组织局部损伤，反复的损伤会引起黄韧带局部炎症反应，炎症反应会导致纤维瘢痕形成和组织纤维化，最终导致黄韧带增生肥厚[9]。炎症的产生过程由多种分子机制介导，目前研究表明诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)/一氧化氮(nitric oxide，NO)和环氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)/前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)是最主要的两个分子机制[10-11]。有研究表明，机械应力作用下可导致黄韧带组织中大量的炎症因子表达水平升高[12]，说明机械应力能诱导黄韧带组织产生局部炎症，而且COX-2/PGE2和iNOS/NO这两个分子机制在黄韧带组织产生炎症的过程中起着重要的作用。Chao等[13]在体外细胞实验中发现，离心力可以诱导人黄韧带细胞产生炎症反应，机械应力可促进PGE2和NO的产生,还能提高白细胞介素(interleukin，IL)-1α、IL-1β、IL-6，以及iNOS和COX-2的表达水平，从而诱导黄韧带组织产生炎症反应，继而导致黄韧带肥厚。Nakamura等[14]在离体细胞实验中发现，在机械应力刺激下黄韧带成纤维细胞中的血管生成素样蛋白2(angiopoietin-like protein 2，Angptl2)表达水平增加，并发现Angptl2表达水平的增加与肥大黄韧带的厚度呈正相关，机械应力刺激下Angptl2表达水平的增加可能是因为黄韧带成纤维细胞中钙调磷酸酶/活化T 细胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)途径的激活，钙调磷酸酶/NFAT途径在纤维化、免疫应答中起着重要作用，在细胞的增殖和凋亡也扮演着重要的角色[15]。Nakamura等[14]研究还发现，肥厚的黄韧带组织中Angptl2表达与转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)mRNA的表达呈正相关，Angptl2可提高TGF-β1及其受体的表达水平，并激活TGF-β1/Smad信号通路，提示Angptl2可能是通过激活TGF-β1/Smad信号通路促进了黄韧带组织变性，从而进一步导致黄韧带肥大。以上实验提示，机械应力刺激作用下活钙调磷酸酶/NFAT途径被激活，从而诱导Angptl2的表达增加，Angptl2通过激活TGF-β1/Smad信号通路导致黄韧带肥厚。Nakamura等[16]研究发现，Angptl2可以通过增加IL-6的表达水平促进黄韧带组织炎症的发生，从而导致黄韧带肥厚。还有学者在皮肌炎的病理学研究中发现，Angptl2可以通过自分泌或旁分泌的方式激活核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)来增加IL-1β和IL-6的表达，从而诱发炎症[17]；而在骨关节炎中，Angptl2则是通过整合素α5、β1诱导软骨细胞中各种炎症相关因子的表达[18]，进一步证实了Angptl2在炎症反应中发挥了重要作用。

胶原蛋白含量增加是黄韧带肥大的原因之一,机械应力能够刺激各种生长因子表达，促进胶原蛋白增加，导致组织中胶原纤维大量堆积，最终引发黄韧带肥厚[19]。大量研究表明，TGF-β1是诱导黄韧带成纤维细胞向肌纤维细胞转化的关键因子，是诱导组织纤维化、促进Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维表达的重要转化生长因子,也是参与免疫反应的重要因子，是组织修复、影响炎症和纤维化的重要生物因子[20-22]。Nakatani等[23]给予体外黄韧带细胞一定的机械拉伸力后发现，黄韧带细胞中的TGF-β1表达水平增加，并且可见Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维大量表达,说明机械应力可以增加促纤维化因子的表达，并导致胶原纤维的堆积。亦有研究表明，通过阻断 TGF-β1的相关信号通路能抑制黄韧带的成纤维细胞向肌纤维细胞转化[24]，表明机械应力刺激下TGF-β1呈高表达，进而引起胶原蛋白增加可能是黄韧带肥厚的分子机制。Hayashi等[25]通过兔子模拟试验研究发现，在机械应力集中作用16周后，黄韧带中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、TGF-β1、成纤维细胞生长因子9(fibroblast growth factors 9，FGF 9)表达水平增高，而FGF 9能够促进新血管形成，参与修复损害的内皮细胞，也是促进组织纤维化的一种生物因子[26-27]。还有研究表明，FGF 9可激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphotidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B/(protein kinase B,Akt)通路，并有助于调节包括干细胞在内的多种细胞的存活、增殖和凋亡[28-29]，认为机械应力引起FGF 9表达水平的增加及激活PI3K-Akt通路可能对于黄韧带变性和肥大起着至关重要的作用。还有研究发现，机械应力可以诱导胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)表达水平增加，说明机械应力的刺激作用能促进黄韧带中IGF-1的表达，再通过激活某些信号通路，使黄韧带胶原纤维增加，最后形成肥厚的黄韧带组织[30]。

综上所述，机械应力可以导致COX-2、iNOS、Angptl2等炎症因子表达水平增加，可能通过COX-2/PGE2和iNOS/NO分子机制，或者TGF-β1/Smad信号通路，使黄韧带局部发生炎症反应，继而发生纤维瘢痕化、纤维增生；同时，机械应力还能诱导黄韧带组织中的TGF-β1、FGF 9、IGF-1等生长因子的表达，使Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维的合成增加，或加速黄韧带组织胶原纤维化，最终导致黄韧带肥厚。机械应力在黄韧带肥厚的过程中起着至关重要的作用，既可以引起局部炎症导致黄韧带形成纤维瘢痕或持续增生导致黄韧带肥厚，也可以诱导生长因子的表达，引起胶原蛋白含量增加，加速黄韧带胶原纤维化，持续的胶原纤维增加导致黄韧带增厚。

3 其他炎症因子在黄韧带肥厚中的作用

近年来的研究发现，许多炎症因子参与黄韧带肥厚的过程，但其具体机制尚未完全明确。有学者发现，椎间盘突出症会产生一些炎性细胞因子，包括IL-1α、IL-6、NO、PGE2、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、MMP等[31-32]。Park等[33]在体外培养的人体黄韧带细胞中加入IL-α、IL-6、TNF-α、PGE2和NO，发现这几类炎症因子能强烈刺激黄韧带细胞，使黄韧带细胞增殖加速，主要表现为黄韧带细胞的DNA合成增加，并上调了Ⅰ型、Ⅴ型和Ⅺ 型胶原mRNA的表达水平，说明IL-α、IL-6、TNF-α、PGE2和NO等炎性细胞因子会影响黄韧带代谢或者促进黄韧带纤维化，从而引起黄韧带肥厚，认为椎间盘突出症产生的炎症因子通过椎管进入周围组织从而作用于黄韧带。Sun等[34]研究发现，肥厚的黄韧带其细胞中瘦素的表达水平显著增加，体外实验中施加外源性瘦素可增加IL-6的表达水平，证实IL-6可以提高黄韧带细胞中的胶原蛋白表达，而瘦素可能是通过NF-κB途径上调IL-6的表达水平。而Sun等[35]的另一个研究发现，微小RNA(microRNA，miRNA)-21通过增加IL-6的表达水平促进黄韧带的纤维化和肥大。有学者研究发现，Janus激酶(Janus-activated kinase,JAK)/信号转导子和转录激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)途径是许多促炎细胞因子如γ-干扰素、α-干扰素、IL-6等的主要信号传导途径[36]。Delen等[37]研究表明，IL-6可能是通过激活 JAK/STAT信号通路，进而诱发黄韧带组织产生炎症，导致黄韧带肥厚。

4 TGF-β1在黄韧带肥厚中的作用

TGF-β1是一个具有多作用、多功能的生物因子，在组织修复、炎症和纤维化中均发挥至关重要的作用。TGF-β1受体的丝氨酸/苏氨酸激酶活性能激活典型的Smad信号通路，通过MAPK-细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)途径介导下游信号传导[38]。除了典型的Smad信号通路，TGF-β1信号通路还包括Jun激酶(Jun kinase，JNK)、p38 MAPK、NF-κB、PI3K-Akt-mTOR等[39]。有研究发现，TGF-β1能刺激α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的表达，α-SMA是成肌纤维细胞的标志物，提示TGF-β1刺激可加速黄韧带的成纤维细胞转变为成肌纤维细胞[40]。此外，肥厚黄韧带的成纤维细胞中α-SMA蛋白表达水平与TGF-β1水平呈正相关，加入外源性TGF-β1可以上调α-SMA mRNA的表达水平，说明TGF-β1通过产生细胞外基质促进黄韧带纤维化[40]。目前有关TGF-β1影响黄韧带肥厚的具体机制尚未完全清晰，但可以肯定的是TGF-β1在黄韧带肥厚过程中起着重要的作用。

5 结缔组织生长因子对黄韧带肥厚的影响

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是一种促纤维化因子，参与纤维化过程，促进细胞增殖、迁移、黏附及细胞外基质合成和新生血管形成等，参与创伤修复[41]。Zhong等[42]研究发现，体外培养的肥厚的黄韧带组织中CTGF表达水平明显升高，CTGF的表达水平与黄韧带厚度呈正相关，外源性增加CTGF可促进Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成，说明CTGF 与黄韧带肥厚有关。卢昌怀等[43]研究发现，给予外源性 TGF-β1 刺激可以促进黄韧带细胞增殖，并可提高CTGF、Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的表达水平，而下调 CTGF的表达水平则可以抑制黄韧带细胞的增生，认为TGF-β1通过提高CTGF 的表达促进黄韧带细胞增生，但其具体机制尚未完全清楚。研究表明，CTGF在肾纤维化、骨骼肌纤维化中均起重要的作用[44-45]，而黄韧带与其他肌腱和韧带一样，均为一种结缔组织，主要由细胞外基质和少量成纤维细胞组成，CTGF在黄韧带纤维化中或许也起着重要的作用。

6 MMP在黄韧带肥厚过程中的作用

MMP是机体一些正常生理过程(如细胞外基质重塑)的关键因子，其参与细胞外基质的降解，并与炎症性疾病(如关节炎、腰椎间盘突出症和心血管疾病)的发生有关[46]。Park等[47]研究发现，MMP在椎管狭窄患者的黄韧带成纤维细胞中高表达，认为MMP可能与弹性蛋白降解和黄韧带纤维化有关。Yabe等[48]研究发现，MMP-2表达水平上调会加速胶原纤维蛋白合成和弹性纤维蛋白的降解，而胶原纤维的合成和弹性纤维降解可能会加速瘢痕的形成。但上述研究均未阐释MMP加速黄韧带纤维化的具体分子机制。有研究表明，黄韧带中弹性纤维的比例与MMP-2 mRNA表达水平呈负相关，而IL-6表达水平与MMP-2 mRNA表达水平呈正相关，并且证实IL-6可以激活STAT3和MMP-2，通过抑制STAT3的表达可以削弱IL-6诱导的MMP-2表达水平的增加[49]，这些结果证明IL-6通过JAK/STAT3信号传导诱导MMP-2的表达和分泌，MMP-2表达的增加促进了弹性纤维的降解，弹性纤维的降解加速了黄韧带肥厚的过程。虽然目前对于MMP影响黄韧带肥厚的机制尚未完全清晰，但是在一些动物实验中发现MMP抑制剂对于纤维化治疗有一定的作用。

7 miRNA在黄韧带肥厚过程中的作用

miRNA是一类非编码内源性RNA分子，可以通过抑制翻译或诱导mRNA降解来调节靶基因表达[50]。miRNA-21是miRNA家族的成员之一，在介导细胞增殖、分化、迁移和炎症中起关键作用[51-52]。Xu等[53]研究发现，miRNA-21过表达可上调黄韧带细胞中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和IL-6的表达水平，认为miRNA-21通过激活IL-6的表达引起了黄韧带组织中的炎症反应，并能促进细胞外基质的表达，从而导致黄韧带肥厚。

8 其他因素对黄韧带肥厚的影响

有研究表明，血管生成和炎症反应之间有密切的关系，两者在黄韧带肥厚的过程中起着重要的作用，在炎性细胞浸润(如巨噬细胞、T淋巴细胞)过程中可以发现IL-6、TGF-β1、Angptl2、血管内皮生长因子的过量产生，血管生成可能参与了炎症反应[16,54]。Hur等[55]在肥大的黄韧带组织发现有丰富的毛细血管形成，而血管内皮生长因子可能是这一过程的关键因素。Jezek等[56]研究发现，血管密度的变化与年龄有关，黄韧带肥厚可能与年龄增长导致的韧带机械性能下降有关。Yüceta等[57]研究发现，过氧化氢酶在肥厚的黄韧带组织中表达降低，过氧化氢酶具有保护细胞免受氧化应激的作用，黄韧带组织中缺乏过氧化氢酶可能会导致细胞加剧氧化，加速黄韧带肥厚的发展，因此过氧化氢酶可能是未来治疗黄韧带肥厚的新方向。Maruf等[58]研究发现，糖尿病会影响黄韧带的纤维化，在糖尿病患者中可以发现晚期糖基化终产物(advanced glycation end product，AGE)堆积于黄韧带组织上，特别是在黄韧带弹性纤维断裂的区域，表明AGE具有分解代谢功能，推测AGE可能是通过COX2/PGE2途径增加了细胞中MMP-2和MMP-9的生物合成，从而加速黄韧带组织的弹性纤维降解，继而促进了黄韧带肥厚进程。有研究显示，维生素D缺乏可能也是导致腰椎椎管狭窄的原因，腰椎管狭窄患者中维生素D缺乏症非常普遍(76.5%)[59]，目前大多数学者认为维生素D缺乏可能会增加腰椎椎管狭窄发生的风险，但维生素D如何对腰椎椎管狭窄产生作用，目前尚未完全清楚。

9 小结与展望

目前，黄韧带肥厚的机制尚未完全清楚，机械应力、炎症反应等对黄韧带肥厚的过程有至关重要的作用。黄韧带肥厚的过程中涉及多种生物因子及生物信号通路，COX-2/PGE2、iNOS/NO可能是诱导黄韧带产生炎症，形成瘢痕组织、瘢痕增生，从而导致黄韧带肥厚的重要信号通路，而PI3K/Akt、IGF-1/Akt/mTORC1则可能是诱导黄韧带组织弹性纤维降解、胶原纤维堆积，加速纤维化，从而导致黄韧带肥厚的重要信号通路；JAK/STAT3、TGF-β1/Smad信号通路可能既参与诱导黄韧带产生炎症，又参与了诱导黄韧带的胶原纤维化过程。虽然目前对黄韧带肥厚发生发展的机制有较多研究，但对于黄韧带肥厚的治疗尚缺乏有效的药物,进一步研究黄韧带肥厚的机制将对其引起的下腰痛的治疗具有非凡的意义。