灯盏细辛对人脉络膜黑色素瘤细胞凋亡的影响及作用机制

李鑫，陈娜，林文娟，袁媛

脉络膜黑色素瘤（choroidal melanoma，CM）多见于40～60 岁人群，属于成人最常见的原发性眼内恶性肿瘤。该病病因未明，可能与内分泌、环境、病毒感染、遗传因素有关[1-2]。CM 属于恶性肿瘤，发展迅速，具有较高的转移率，主要采取眼球摘除方法治疗但对于远处转移的CM 患者，尚无有效治疗方法[3-4]。因此，寻找一种疗效好、副作用小、安全性高的治疗药物迫在眉睫。灯盏细辛具有抑制氧化反应、降血脂、杀菌消毒、抗肿瘤等药理作用[5-6]。以往关于灯盏细辛对眼组织保护作用的研究大都集中在动物体内模型[7-8]，因此，本研究拟在细胞水平进一步研究灯盏细辛对CM 细胞凋亡的促进作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人眼侵袭性CM 细胞系OCM-1（美国ATCC 公司，批号：DSM 4855），98%灯盏细辛注射液（武汉博士德生物工程有限公司，批号：20150112），二甲基亚砜、胎牛血清、达尔伯克改良伊格尔培养基培养液(dulbecco’s modification of eagle’s medium dulbecco，DMEM）、CCK-8 细胞增殖检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：KGA317），4%多聚甲醛（北京百奥莱博科技有限公司，批号：BTN131248），0.1%胰酶（北京索莱宝生物公司，批号：P7340），Hoechst 33258 染色试剂盒（南京建成生物研究所，批号：G003-1-2），Annexin-V 和PI 试剂盒（北京索莱宝生物公司，批号：CA1020），双辛酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白测定试剂盒、聚氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（上海碧云天公司，批号：P0010S；FFP24），Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）及B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（上海碧云天公司，批号：AF0057；P7257），酶标仪（北京中西华大科技有限公司，型号：M399038），流式细胞仪（美国BD公司，型号：DLK0002563），电泳仪（北京恒奥德仪器仪表有限公司，型号：HAD-JY600C），荧光显微镜（上海无陌光学仪器有限公司，型号：WMF-3530LED）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 在含10%胎牛血清的DMEM 培养基（青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL）中培养OCM-1 细胞，培养箱内温度为37℃，CO2体积分数为5%，每3 d 传代1 次，更换新鲜培养液，取对数期生长的细胞进行实验，细胞密度达到80%左右，用胰酶消化进行实验。

1.2.2 细胞分组 接种于96 孔板中，共分4 组，每组5 个复孔。（1）对照组（NC 组）：正常培养液培养细胞。（2）灯盏细辛组：以灯盏细辛浓度不同分为3 个亚组。灯盏细辛低浓度组（LC 组），即在培养基中加入1 μmol/L 的灯盏细辛溶液；灯盏细辛中浓度组（MC 组），即在培养基中加入10 μmol/L 的灯盏细辛溶液；灯盏细辛高浓度组（HC 组），即在培养基中加入100 μmol/L 的灯盏细辛溶液。每组均培养48 h。

1.3 CCK-8 法检测OCM-1 细胞增殖率

OCM-1 细胞接种于96 孔培养板中，按照上述方法随机分4 组，100 μL/孔，培养箱中培养48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在37℃恒温箱中孵育1 h，用酶标仪检测450 nm 光密度（optical density，OD）值。

1.4 Hoechst 33258 染色法检测凋亡

细胞接种于12 孔板中，调整细胞密度至5×104个/mL，4%多聚甲醛固定细胞10 min，去固定液并用PBS 冲洗2 次，PBS 洗涤时手动晃动数次。加入Hoechst 33258 染色液后室温避光反应10 min，PBS 洗涤2 次后，再超净台中避光风干，倒置荧光显微镜下观查并拍照。

1.5 应用Annexin V/PI 染色剂进行流式细胞技术检测凋亡

OCM-1 细胞接种于6 孔板中，0.1%胰酶（不含乙二胺四乙酸）消化各组细胞后制备细胞悬液。1000 r/min 离心后，收集细胞并转移至含有300μL 缓冲液的离心管中，分别加入5μLAnnexin-V 和10μLPI溶液，室温下避光反应30min 后上机检测细胞凋亡率。

1.6 Western blot 法检测OCM-1 细胞内Bax 及Bcl-2 的蛋白表达

提取蛋白质后行聚丙烯酰胺凝胶电泳，设置一抗稀释浓度为1:1000，二抗稀释浓度为1:2000，电化学发光法显影，统计学分析结果以样本目的蛋白的OD 比内参条带的OD，计算相对表达率。

1.7 统计学方法

用SPSS18.0 统计学软件分析数据。计量资料用均值±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OCM-1 细胞的增殖率比较

4 组间比较，差异有统计学意义（F=6.453，P=0.014）。与NC 组比较，各组均明显降低，差异有统计学意义（tLC=8.806，tMC=9.293，tHC=12.832，均P=0.000）。与LC组比较，MC 组降低不明显，差异无统计学意义（t=1.783，P=0.112）；HC 组明显降低，差异有统计学意义（t=5.639，P=0.000）。HC 组比MC 组明显降低，差异有统计学意义（t=4.214，P=0.000）（表1）。

表1 4 组OCM-1 细胞的增殖率、凋亡率、Bax 和Bcl-2 比较（，n=5）

表1 4 组OCM-1 细胞的增殖率、凋亡率、Bax 和Bcl-2 比较（，n=5）

注：NC 组 对照组；LC 组 灯盏细辛低浓度组；MC 组 灯盏细辛中浓度组；HC 组 灯盏细辛高浓度组；* 与NC 组比较，P＜0.05；# 与LC 组比较，P＜0.05；△与MC 组比较，P＜0.05

2.2 OCM-1 细胞的凋亡比较

Hoechst 33258 染色剂可以进入凋亡细胞的细胞核，在荧光显微镜下，表现为致密颗粒状强荧光集聚（亮蓝色高荧光），以HC 组最为明显（图1）。

图1 OCM-1 细胞凋亡图（×200）。1A 对照组，可见均匀一致的暗黑色背景；1B 灯盏细辛低浓度组，可见高荧光类圆形细胞核，为凋亡细胞；1C 灯盏细辛中浓度组，可见高荧光类圆形细胞核数量增加；1D 灯盏细辛高浓度组，可见弥漫分布的凋亡细胞

流式细胞技术结果显示，4 组间凋亡率比较差异有统计学意义（F=9.440，P=0.003）。与NC 组比较，各组均明显升高，差异有统计学意义（tLC=7.760，tMC=9.776，tHC=14.650，均P=0.000）。与LC 组比较，MC 组升高不明显，差异无统计学意义（t=0.535，P=0.607），HC 组升高明显，差异有统计学意义（t=11.140，P=0.000）。HC 组比MC 组明显升高，差异有统计学意义（t=11.020，P=0.000）（表1）。

2.3 Bax 及Bcl-2 蛋白的表达比较

4 组间Bax 相对表达量比较，差异具有统计学意义（F=5.114，P=0.012）。与NC 组比较，各组均升高，差异均有统计学意义（tLC组=10.750、tMC组=20.813、tHC组=81.881，均P=0.000）。与LC 组比较，MC 组降低，HC组升高，差异均有统计学意义（tMC=17.48，tHC=19.433，均P=0.000）。HC 组比MC 组升高，差异有统计学意义（t=3.680，P=0.006）（表1、图2）。

4 组间Bcl-2 相对表达量比较，差异有统计学意义（F=5.694，P=0.010）。与NC 组比较，各组均降低，差异均有统计学意义（tLC=4.648，P=0.002；tMC=6.197，tHC=14.334，均P=0.000）。与LC 组比较，MC 组和HC组均降低，差异均有统计学意义（tMC=3.043，P=0.016，tHC=9.767，P=0.000）。HC 组比MC 组降低，差异有统计学意义（t=7.267，P=0.000）（表1、图2）。

图2 OCM-1 细胞内Bax 及Bcl-2 蛋白表达变化图

3 讨论

CM 始发于脉络膜大血管层，可以发生于脉络膜的任何部位，但常见于眼的后极部。如果瘤体生长于周边部眼底，患者可无明显症状；如瘤体生长于后极部，则表现为屈光度数增加、视物变形、视力下降、视野缺损，瘤体增大并继发视网膜脱离时视力严重下降[9-10]。CM 发病机制并不明确，治疗方案存在很大争议，手术辅以放疗和化学药物治疗是主要方法[11]。

对于肿瘤疾病，采用新的药物诱导细胞凋亡来治疗肿瘤疾病已经成为研究热点[12]。灯盏细辛为菊科植物短葶飞蓬全草的主要活性成分，具有天然、低毒、高效、价格低廉的特征[5-6]。李奕萍[13]通过观察银杏叶提取物联合灯盏细辛对青光眼小梁切除术后患者疗效，发现两者联合应用可以有效提高青光眼患者术后视力水平，改善视野并降低眼内压。本研究考察了灯盏细辛对OCM-1 细胞的细胞毒作用及其作用机制。CCK-8 结果显示，灯盏细辛抑制了OCM-1细胞的生长，且有浓度依赖性。判断细胞凋亡最直观方法为细胞形态学观察。Hoechst 33258 核染色法直接显示了灯盏细辛能够诱导OCM-1 细胞凋亡。此外，Annexin V/PI 检测结果从另一个角度认证了灯盏细辛对OCM-1 细胞凋亡的促进作用。

细胞凋亡具有复杂的分子生物学特征，涉及一系列基因的表达、调控及激活，从而使机体更好的适应生存环境。细胞凋亡过程中清除了异常细胞，保证了生物体内环境的稳定，为促进系统发育发挥作用[14]。多种因素（衰老、药物、氧化损伤、射线）能够诱发凋亡反应，当机体正常的凋亡过程受到破坏或凋亡过程紊乱时，引发多种疾病，例如自身免疫性疾病及肿瘤[15]。本实验除了通过观察灯盏细辛对OCM-1细胞增殖率、凋亡率的影响，还进一步从机制学方面探讨了灯盏细辛的作用机理。Bcl-2 家族是线粒体凋亡途径中的重要调节因素，其中，Bcl-2 属于抗凋亡基因，Bax 属于促凋亡基因，通过调节线粒体膜的通透性诱导细胞凋亡[16]。本研究发现，灯盏细辛诱导了OCM-1 细胞Bax 蛋白表达上调，Bcl-2 蛋白表达下调。

综上所述，灯盏细辛通过改变线粒体凋亡途径中凋亡相关信号分子Bax 及Bcl-2 的表达，浓度依赖性的抑制了OCM-1 细胞的生长并促进细胞凋亡，有望成为临床上治疗CM 的有效药物。