lncRNA Gm4419靶向miR-703对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化应激和凋亡的影响

杨庆华 杨隆良 杨晓莉

阿尔茨海默病(AD)是一种常见于老年人的复杂中枢神经系统的慢性退行性疾病，表现为记忆丧失、认知和行为功能的永久性损害以及各种精神障碍，是导致老年人痴呆的主要原因。随着全球人口老龄化发展，AD发病率逐年增加，已成为一种普遍的健康问题[1]。由于对AD发生、进展机制认识有限，目前临床仍缺乏有效方法来阻止或延缓疾病进展。长链非编码RNA(lncRNA)作为表达遗传调控分子通过染色质修饰、转录调控等多种方式发挥生物活性，参与调控细胞存活、凋亡、氧化应激、炎性反应等多种病理生理过程，在包括AD在内的等多种神经退行性疾病发挥作用[2,3]。研究显示lncRNA Gm4419在糖尿病肾病中表达上调，敲低其表达可抑制炎性反应[4]。Gm4419通过激活NF-κB信号上调趋化素表达诱导神经细胞凋亡进而促进高血压性脑动脉硬化恶化[5]。然而Gm4419在AD进展中的作用和分子机制并不清楚。miR-703是一种心肌梗死保护性miRNA，研究显示miR-703通过抑制心肌细胞焦亡保护缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤[6]。序列分析发现miR-703是Gm4419的潜在靶基因，但Gm4419是否靶向miR-703参与AD进展尚未有研究。β-淀粉样肽25-35(Aβ25-35)是一种短分子片段，具有全长肽的毒性，其诱导的PC12细胞损伤在AD体外研究中已广泛应用[7,8]。因此，本研究重点探讨Gm4419和miR-703对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化应激和细胞凋亡的影响，分析二者靶向调控关系，以期为防治AD提供有效靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料 大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12购于中国科学院上海细胞库；Aβ25-35(取适量Aβ25-35溶于无菌三蒸水中制成1 mmol/L储存液，-20℃冰箱避光保存备用)购于上海樊克生物科技有限公司；逆转录酶、SYBR green master mix购于大连宝生物公司；小干扰RNA(si-RNA)、miRNA模拟物(mimics)、miRNA抑制物(anti-miR)、过表达载体(pcDNA-RNA)由广州复能基因公司提供；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)试剂盒购于北京博奥森生物；兔源B细胞淋巴瘤(Bcl-2)抗体、兔源Bcl相关x蛋白(Bax)抗体、兔源磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体购于上海碧云天生物公司；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒、丙二醛(MDA)含量测定试剂盒购于北京索莱宝生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:复苏PC12细胞后，将其接种在含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基中置于37℃、含5%CO2的培养箱中培养。每2～3天更换1次培养液，取对数生长期的细胞进行后续实验。实验前1 d用含50 μg/L的神经生长因子诱导PC12分化使其具有神经细胞特性。

1.2.2 实验分组:对照组(Con组)为未经任何处理的PC12细胞；Aβ25-35组为用含40 μmol/L培养液孵育PC12细胞48 h[9]；Aβ25-35+si-NC组、Aβ25-35+si-Gm4419组、Aβ25-35+miR-NC组、Aβ25-35+miR-703组为将si-NC、si-Gm4419、miR-NC、miR-703 mimics分别转染PC12细胞后，用含40 μmol/L Aβ25-35培养液孵育细胞48 h；Aβ25-35+si-Gm4419+anti-miR-NC组、Aβ25-35+si-Gm4419+anti-miR-703组为将si-Gm4419+anti-miR-NC、si-Gm4419+anti-miR-703分别转染PC12细胞后，用含40 μmol/L Aβ25-35培养液孵育细胞48 h。细胞转染为采用脂质体Lipofectamine 2000进行瞬时转染，收集转染48 h细胞进行Aβ25-35处理。

1.2.3 实时定量PCR(RT-qPCR)分析Gm4419和miR-703表达量:按照Trizol试剂使用说明书提取各组PC12细胞总RNA，分光光度计法测定其浓度后置于-80℃冰箱保存。利用逆转录酶将RNA反转录为cDNA，再利用SYBR green master mix进行RT-qPCR。Gm4419和miR-703表达量以2-ΔΔCT法计算。Gm4419上游引物5’-GGAACCA AGCAGACCGAAGAC-3’，下游引物5’-CCC CAACCCACAGGAACATAA-3’；内参GAPDH上游引物5’-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3’，下游引物5’-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3’。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡:收获各组PC12细胞，磷酸盐缓冲液洗涤后重悬于500 μl结合缓冲液中，分别加入加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl的PI，混匀后暗室孵育15 min，流式细胞仪分析细胞凋亡。

1.2.5 蛋白质印记法(western blot)检测Bcl-2和Bax蛋白表达量:放射免疫沉淀试验(RIPA)缓冲液提取各组PC12细胞总蛋白。蛋白定量后，将适量蛋白与等体积上样缓冲液混合煮沸3 min变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上。膜封闭后，4℃下用抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体孵育膜过夜。室温下再用二抗孵育膜2 h。化学发光法显影、定影，曝光后，采用Image J软件分析各条带灰度值，目的蛋白表达量以对应蛋白和内参GAPDH灰度值比值表示。

1.2.6 ELISA试剂盒检测SOD活性、MDA含量:收集各组PC12细胞至离心管内，离心(1 000 g)10 min弃上清液，加入提取液超声破碎细胞，4℃下离心(8 000 g)10 min获得上清液，置于冰上备用。随后按照试剂盒步骤测定SOD活性以及MDA含量。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验:将含有miR-703结合位点序列的Gm4419野生序列或Gm4419突变序列分别克隆到荧光素酶报告质粒构建野生型或突变型荧光素酶报告载体WT-Gm4419或MUT-Gm4419。将WT-Gm4419、MUT-Gm4419分别与miR-703 mimics、miR-NC共转染PC12细胞，在转染48 h时裂解细胞并检测荧光素酶活性。同时将pcDNA、pcDNA-Gm4419、si-NC、si-Gm4419分别转染PC12细胞，RT-qPCR检测细胞中miR-703表达量。

2 结果

2.1 lncRNA Gm4419和miR-703在Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤中的表达 Aβ25-35组PC12细胞Gm4419表达量显著高于Con组(P<0.05)，miR-703表达量显著低于Con组(P<0.05)。见表1。

表1 lncRNA Gm4419和miR-703在Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤中的表达

2.2 抑制lncRNA Gm4419表达对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化应激和细胞凋亡的影响 与Con组比较，Aβ25-35组PC12细胞Gm4419表达量、凋亡率、Bax蛋白表达量、MDA含量显著升高(P<0.05)，SOD活性、Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)；与Aβ25-35+si-NC组比较，Aβ25-35+si-Gm4419组PC12细胞Gm4419表达量、凋亡率、Bax蛋白表达量、MDA含量显著降低(P<0.05)，SOD活性、Bcl-2蛋白表达量显著升高(P<0.05)。见图1，表2。

图1 抑制lncRNA Gm4419表达对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡的影响;A 凋亡相关蛋白表达；B 细胞凋亡流式图

表2 抑制lncRNA Gm4419表达对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化应激和细胞凋亡的影响

2.3 miR-703过表达对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化应激和细胞凋亡的影响 与Aβ25-35+miR-NC组比较，Aβ25-35+miR-703组PC12细胞miR-703表达量、SOD活性、Bcl-2蛋白表达量显著升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表达量、MDA含量显著降低(P<0.05)。见图2，表3。

图2 miR-703过表达对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化应激和细胞凋亡的影响;A 凋亡相关蛋白表达；B 细胞凋亡流式图

表3 miR-703过表达对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化应激和细胞凋亡的影响

2.4 lncRNA Gm4419靶向调控miR-703的表达 LncBase Predicted v.2在线分析显示Gm4419与miR-703存在特异性结合位点。miR-703 mimics和WT-Gm4419共转染后细胞荧光素酶活性较miR-NC和WT-Gm4419共转染显著降低(P<0.05)，而miR-703 mimics和MUT-Gm4419共转染后细胞荧光素酶活性与miR-NC和MUT-Gm4419共转染比较无显著变化。pcDNA-Gm4419组细胞中miR-703表达量较pcDNA组显著降低(P<0.05)，而si-Gm4419组细胞中miR-703表达量较si-NC组显著升高(P<0.05)。见表4、5，图3。

表4 双荧光素酶报告实验

2.5 抑制miR-703表达逆转了lncRNA Gm4419抑制

表5 lncRNA Gm4419调控miR-703的表达

图3 lncRNA Gm4419的序列中含有与miR-703互补的核苷酸序列

对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化应激和细胞凋亡的作用 与Aβ25-35+si-Gm4419+anti-miR-NC组比较，Aβ25-35+si-Gm4419+ anti-miR-703组PC12细胞miR-703表达量、SOD活性、Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表达量、MDA含量显著升高(P<0.05)。见表6，图4。

表6 干扰miR-703表达逆转了抑制lncRNA Gm4419表达对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化应激和细胞凋亡的作用

图4 干扰miR-703表达逆转了抑制lncRNA Gm4419表达对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡的作用；A 凋亡相关蛋白表达；B 细胞凋亡流式图

3 讨论

AD可导致神经元损伤和大脑认知能力退化，是老年痴呆症发生的最主要原因。近年来。多项研究证实lncRNA参与了AD相关病理过程。如lncRNA核富含丰富的转录本1(NEAT1)在Aβ25-35诱导的神经元细胞中表达增加，下调其表达减弱Aβ25-35对细胞活力的抑制作用，并促进神经元凋亡、增加Tau蛋白磷酸化水平[10]。上调lncRNA母系表达基因3(MEG3)可改善AD大鼠认知障碍，减轻神经损伤，抑制星形胶质细胞的激活和炎性反应[11]。本研究中Aβ25-35诱导的PC12损伤后Gm4419表达水平升高提示Gm4419表达改变可能与AD患者神经元损伤。转染si-Gm4419进行功能验证发现，抑制Gm4419表达显著减弱Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡。与本研究发现类似，抑制Gm4419表达可抑制缺氧复氧诱导的肝或心肌细胞凋亡保护肝或心肌缺血再灌注损伤[12,13]。Bcl-2和Bax蛋白是线粒体凋亡途径的作用调节因子，Bax移位导致线粒体通透性增加促进细胞色素c等蛋白释放进而启动caspase依赖性凋亡发生，Bcl-2通过与Bax结合具有抗凋亡作用[14]。本研究中抑制Gm4419表达显著降低Aβ25-35诱导的PC12细胞中Bax蛋白水平，升高Bcl-2表达水平，与其抗凋亡作用一致。氧化应激是神经退行性疾病发生的始动因素，其可促进Aβ沉积、tau蛋白过度磷酸化以及随后突触和神经元的丢失，直接参与AD发生和进展[15]。MDA是脂质过氧化的终产物，通过检测细胞中MDA水平可有效反应细胞氧化损伤程度[16]。本研究中发现抑制Gm4419表达显著降低Aβ25-35诱导的PC12细胞中MDA含量，并提高SOD活性。以上研究提示抑制Gm4419表表达可减轻Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡和氧化应激损伤。

大量研究表明lncRNA通过与miRNA相互作用抑制miRNA活性是其发挥生物学功能的重要机制。如沉默lncRNA牛磺酸上调基因1(TUG1)通过上调miR-15a表达可改善AD小鼠的空间学习、记忆能力，改善病理损伤，增强海马神经元抗氧化能力，抑制神经元凋亡[17]。lncRNA肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)通过靶向miR-125b显著抑制神经元凋亡、神经炎症，刺激神经突生长[18]。本研究发现Aβ25-35诱导的PC12损伤后miR-703表达降低，进一步研究证实miR-703是Gm4419的靶基因，且过表达或抑制Gm4419分别下调或上调miR-703表达水平。转染miR-703进行功能分析发现过表达miR-703显著抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡和氧化应激损伤，与抑制Gm4419表达的保护作用一致。进一步恢复实验显示，抑制miR-703表达显著减弱Gm4419抑制对Aβ25-35诱导的PC12细胞和氧化应激损伤的保护作用，这进一步说明Gm4419可能通过靶向负调控miR-703表达参与Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤。但本研究仍限于体外研究，后续将在动物模型中进一步确定lncRNA Gm4419/miR-703分子轴在Aβ25-35诱导PC12细胞损伤中的作用。

总之，本研究证实抑制lncRNA Gm4419通过上调miR-703表达能够减轻Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡和氧化应激损伤，这为靶向lncRNA Gm4419/miR-703分子轴防治AD奠定理论基础。