尚玺胶囊的抗炎作用及其对血清IL-1β、TNF-α和炎症组织中PGE2的影响

韩鸾玮，牛雪妮，吕重宁，路金才*

（沈阳药科大学中药学院·辽宁沈阳·110016）

尚玺胶囊是以葡萄提取物、姜黄提取物、罗布麻提取物、绞股蓝提取物、三七提取物、淀粉和硬脂酸镁为主要原料制成的保健食品,其代表性化学成分是白藜芦醇和总皂苷。白藜芦醇(Resveratrol,Res),是从葡萄中提取的重要活性成分,是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物（化学名为三羟基芪）,具有显著的药理及生物学作用：抗炎、抗癌、抗氧化、保护心血管、保护脑神经、抗衰老、调节雌激素、抗增殖、抗突变等[1-7],基于此,本实验对尚玺胶囊的抗炎活性进行了评估。角叉菜胶诱导急性炎症导致足肿胀,是筛选抗炎药的常用测试方法[8]。角叉菜胶引起的足肿胀包括两个发展阶段：第一阶段与组胺、5-羟色胺和激肽的释放有关,而第二阶段与前列腺素的释放有关[9]。因此,我们通过建立角叉菜胶所致大鼠足肿胀模型,探索尚玺胶囊抗炎活性可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 药物与试剂

角叉菜胶（批号：81K1556）购自Sigma；冰醋酸（批号：190304）购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；羧甲基纤维素钠（批号：190124）和氢氧化钾（批号：191025）购自天津博迪化工股份有限公司；分析级甲醇（批号：190624）和乙醇（批号：190624）购自天津永达化学试剂有限公司；纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司；白藜芦醇（批号：111535-201703；含量：99.4%）购自中国食品药品检定研究院；尚玺胶囊（鲁食健生证（临）字20140008号）购自济南大医科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（WST-1方法；批号190723）和丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA方法；批号190725）购自南京建成生物工程研究所；大鼠白介素1β（IL-1β）酶联免疫吸附测定试剂盒（货号：E-EL-R0012c）和大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒（货号：E-ELR2856c）购自Elabscience。

1.2 实验动物

SD雄性大鼠40只,体重180～220g,北京华阜康生物技术有限公司,许可证号SCXK（京）2019-0001。

1.3 实验仪器

医用离心机80-2型（江苏新康医疗器械有限公司）；恒温数显水浴锅DFD700（天津泰斯特公司）；分析天平BS124S型（赛多利斯公司）；超声波清洗器KQ5200E型（昆山市超声仪器有限公司）；全波长多功能酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 尚玺胶囊对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响

将30只体重为150～200g的SD雄性大鼠随机分为5组（每组6只）：高剂量给药组（450 mg·kg-1）,中剂量给药组（300 mg·kg-1）,低剂量给药组（150 mg·kg-1）,阳性组（白藜芦醇10 mg·kg-1）,对照组,详见表1。称重,标号。将大鼠在温度（21±2℃）,相对湿度（20%）和12/12小时的明暗循环的标准条件下,给予饲料和水。

表1 实验动物分组与给药剂量

正常饲养两天后开始灌胃给药,模型组每只灌胃等体积2 mL 0.4%羧甲基纤维素钠溶液,给药组按相应剂量进行给药（受试药以0.4% CMC-Na制成混悬液）。每天灌胃给药一次,连续7天,自由进食进水,每日观察大鼠活动状态。在最后一次给药1小时后,皮下注射角叉菜胶（1% w/v）。进入右后爪的足底表面（0.1 mL/爪）以诱发炎症,随后出现水肿。在注射角叉菜胶之前测量右爪的足周径（在此划线以便后续测量）,然后在0、0.5、1、2、3、4 h分别测量足周径。并计算肿胀度与抑制百分率,计算公式如下。

在测量致炎后2小时的足周径之后,每只大鼠眼眶静脉取血1.5 mL。放置20分钟后,将其以6000 rpm离心5分钟,取血清,并储存在-20℃的冰箱中使用。测量4小时后,通过颈椎脱臼法处死大鼠,沿标记线剪下炎足,脱皮剪碎,在2.5 mL生理盐水中浸泡24 h,3000转·min-1离心10 min,取上清液,-20℃冰箱冷藏备用。

肿胀度与抑制率结果见表2。数据表明,尚玺胶囊在1至4小时内炎症足爪肿胀度显著降低。此外,在300 mg·kg-1的剂量下,抑制率在2 h达到峰值,为7.58%（P＜0.05）,与白藜芦醇相当,后者的抑制率约为8.30%（P＜0.05）；当剂量为450mg·kg-1时,足肿胀抑制效果优于白藜芦醇。这表明尚玺胶囊具有显著的抗炎作用,并且是剂量依赖性的。

表2 尚玺胶囊对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀的足周径和抑制率

2.2 血清中SOD活力、MDA含量测定

取2.1项下的血清并分别按照SOD测定试剂盒和MDA测定试剂盒中的说明书进行测定。结果见表3。

2.3 炎症足爪中PGE2含量测定

取2.1项下的炎足上清液0.6 mL,加入0.5 mol/L KOH-甲醇2 mL,50℃水浴异构化20 min,甲醇稀释至5 mL,于278 nm处测PGE2含量。根据以下公式计算PGE2含量：PGE2含量（μg·g-1）=（E278×13.13×Vt×D）/W。这里,Vt=PGE2测定过程中浸泡溶液的体积,D=稀释因子,W=炎足的重量（g）,E278=在278 nm处的吸收值。结果见表3、图1。

图1 SOD活力、MDA含量、PGE2含量比较

表3 SOD活力、MDA和PGE2含量测定结果

结果表明,与对照组相比,各给药组MDA、PGE2的含量均降低,SOD活力均提高；其中,中剂量组（300 mg·kg-1）所测各指标变化显著（但不及阳性药组）,低剂量组所测各指标变化相对较小。

2.4 血清中IL-1β和TNF-α的含量测定

取2.1项下的血清并参照ELISA试剂盒说明书进行操作,测定血清中IL-1β和TNF-α的含量。结果见表4。

表4 血清中IL-1β和TNF-α含量测定结果

结果表明,与对照组相比,各给药组TNF-α和IL-1β的含量均降低,其中,中剂量组（300 mg·kg-1）所测各指标变化显著,低剂量组所测各指标变化相对较小。提示给予大鼠尚玺胶囊300 mg·kg-1剂量具有一定的抗炎作用。

2.5 统计方法

实验采用SPSS 17.0软件进行分析,实验数据以平均值±标准差(±s)表示,组间比较应用方差分析,P＜0.05即认为统计具有显著性差异。

3 讨论

炎症是机体对损伤因子所发生的一种特异性防御反应,与花生四烯酸代谢有直接关系[10]。机体的花生四烯酸主要通过环氧化酶和脂氧化酶两条途径进行代谢,分别产生前列腺素和白细胞三烯等致炎物质,其中,PGE2是一种重要的炎症介质。在前列腺素的合成过程中伴有氧自由基的生成,且两者的合成存在协同效应［11-12]。然而研究表明,大量的自由基可以引起膜脂质过氧化增强,破坏生物膜的结构和功能,形成一系列脂质自由基及其降解产物MDA,使SOD等清除自由基的酶活性降低,但相关酶活性降低的同时又不能有效降解已产生的大量的自由基,形成恶性循环,加重组织损伤[13]。

由于本品中已知的成分白藜芦醇具有很好的抗炎活性,因此我们选用角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀模型,并测定其血清中SOD活力、MDA含量和炎性组织中PGE2含量评价了尚玺胶囊的抗炎活性。结果表明尚玺胶囊在给药量为300 mg·kg-1时能降低大鼠毛细血管通透性、减少炎症渗出,对急慢性炎症反应有显著抑制作用。另外,它能明显降低大鼠足爪局部炎症组织中PGE2含量和血清中MDA含量,这表明尚玺胶囊的抗炎作用可能与减少炎症组织中PGE2合成和抑制组织炎症中脂质过氧化产物的形成有关。

研究表明,白藜芦醇抗炎活性的作用机制与减少炎症因子、抑制COX-2/PGE2信号通路有关[14-15]。而在本研究中,尚玺胶囊在给药量为300 mg·kg-1时能明显降低大鼠血清中TNF-α含量,这表明尚玺胶囊能明显下调角叉菜胶诱导足肿胀大鼠炎症因子TNFα的表达,降低大鼠血清中炎症因子含量,进而改善炎症症状,这对于进一步探究尚玺胶囊抗炎作用的机理提供了重要的依据。