柴胡茎叶总黄酮生物活性研究

丛登立，孟宪兰，李鹏飞

（1.吉林大学药学院，长春130021；2.通化盛吉信生物科技股份有限公司，通化134008；3.修正药业集团股份有限公司，通化134008）

柴胡始载于《神农本草经》,列为上品,称之为地熏、茈胡,《本草纲目》载“治阳气下陷,平肝、胆、三焦,包络相火以及头痛、眩晕、目昏诸疟及妇人热入血室、经水不调、小儿痘疹余热、五疳羸热”等。柴胡作为传统中药材具有疏散退热,疏肝解郁,升举阳气作用。临床常用于感冒发热,寒热往来,胸胁胀痛,月经不调,子宫脱垂,脱肛等病症[1]。药典2020版规定柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzoneri-folium Willd.的干燥根。近代对柴胡根研究较多,柴胡根中主要有效成分是柴胡皂苷[2],具有抗炎、保肝、对心血管系统、免疫系统和神经系统起作用等多种生物学活性[2],具有抗肿瘤作用,其对多种肿瘤的发生、发展有抑制作用[3,4,5,6]。一直以来,柴胡根用于入药,地上部分茎叶弃之不用,造成柴胡地上部分资源大量浪费,近年不断有实验研究发现柴胡地上部分茎、叶含有黄酮类等多种有效成分,具有解热镇痛、对心血管系统具有一定治疗作用[4,6]。本文对柴胡地上部分茎叶总黄酮提取方法及茎叶总黄酮生物活性进行抗疲劳作用研究,为挖掘柴胡的药用部位,更好地开发利用柴胡这一传统中药提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药材柴胡地上部分茎和叶(柴胡采自吉林省榆树市大坡镇柴胡种植基地,经吉林农业大学胡广权教授鉴定为北柴胡),自然晾干。

1.1.2 实验动物

健康昆明种小鼠,6～8周龄,体质量20.0～22.0g,由吉林大学实验动物中心提供,动物合格证号：医动字第（吉）2020-0001。

1.1.3 试剂

肝糖原、肌糖原、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）、血乳酸（blood lactic acid,LAC）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；无水乙醇（AR）购自成都科隆化学品有限公司。

1.1.4 主要仪器

紫外可见分光光度计(日本日立HITACHI U-1900)；Eppendorf高速离心机(contrifuge5810R)；EL204万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；RE-52A真空旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SIB-III型循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 柴胡茎叶总黄酮提取

采用正交实验对提取条件（溶剂浓度、浸泡时间、料液比、提取时间）进行优化,以柴胡茎叶总黄酮提取率和浸膏得率为指标确定柴胡茎叶总黄酮提取方法。

称取柴胡地上部分粗粉2.00g,置入1000mL烧瓶,并加入体积分数50%乙醇溶液200mL,室温浸泡过夜,然后电热套加热回流60min,冷却后减压过滤,滤液在旋转蒸发仪上60℃以下减压蒸干称重得117mg,柴胡茎叶总黄酮提取率5.85%。同法制备柴胡茎叶总黄酮水溶液1.0g·mL-1备用。

1.2.2 实验动物分组与用药健康昆明种小鼠,雌雄各半随机分为5组,每组10只：阴性对照组（蒸馏水）、阳性对照组（复方高山红景天口服液）和3个不同剂量柴胡茎叶总黄酮水溶液组即低剂量组（浓度为0.25g·mL-1）；中剂量组（浓度为0.5g·mL-1）和高剂量组（浓度为1.0g·mL-1）。小鼠分笼饲养,标准动物饲养室适应性喂养7d后,3个给药组按规定剂量每天分别灌胃。阳性对照组每天用复方高山红景天口服液灌胃,每次灌胃量按小鼠体质量以0.02g·mL-1灌胃,阴性对照组每天灌胃同量蒸馏水。实验周期为4周。

1.2.3 运动小鼠肝糖原和肌糖原含量活力测定

各组最后1次给药后20min,将小鼠尾部负荷2g的铅块,放入25.0℃±0.5℃的水中游泳60min,出水休息20min后,眼眶取血,肝素抗凝,立即脱颈椎处死。取肝脏和肌肉样本各100mg,用生理盐水2mL漂洗后滤纸吸干,按标本质量（mg）：碱液体积（μL）=1：3（即肝脏、肌肉10mg与300μL碱水）加入试管中,每管匀浆3～5min,匀浆液以3000r·min-1离心10min,上清液置沸水浴煮20min,流水冷却,加入蒸馏水定溶。按试剂盒要求加入试剂。混匀后置沸水中煮5min,冷却后于620nm波长,测定各管吸光度（A）值。

1.2.4 运动小鼠LDH活力及LAC、BUN含量测定

最后1次给药20min后,将小鼠尾部负荷2g的铅块,放入25.0℃±0.5℃的水中游泳60min,出水后休息20min,眼眶取血1次。所得血液样品加入0.3mL蛋白沉淀剂和肝素抗凝后轻轻颠倒混匀,静置10min后,以3000r·min-1离心8min,分离血清。分别采用LAC、BUN、LDH相关试剂盒并按要求测定。

1.2.5 运动耐力测定

各组在最后1次给药30min后,将小鼠放入水深30cm、水温25.0℃±0.5℃的水中游泳,鼠尾部负荷2g的铅块,记录小鼠自游泳开始至力竭死亡的时间（小鼠自游泳开始至沉入水中10 s不能浮出水面,且放在平面时无法完成翻正反射的连续游泳时间）。

1.2.6 运动小鼠SOD活力测定

各组在最后1次给药30min后,将小鼠尾部负荷2g的铅块,放入25.0℃±0.5℃的水中游泳60min,出水后休息30min立即脱颈椎处死。取肝组织约200mg在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,试纸拭干,称质量,放入盛有组织块质量9倍的预冷的生理盐水玻璃杯内。尽快剪碎组织块,并倒入匀浆管中进行匀浆。将制备好的10%匀浆用低温离心机3500r·min-1离心10min。采用SOD试剂盒测定。

1.2.7 统计学分析

2 结果分析

2.1 柴胡茎叶总黄酮提取条件优化结果

柴胡茎叶总黄酮提取溶剂浓度为50%、提取前浸泡过夜、溶剂用量为药材的10倍、最优的提取时间为60min,柴胡地上部分总黄酮提取率及浸膏得率为最佳条件选择指标。

2.2 柴胡茎叶总黄酮对运动小鼠肝糖原、肌糖原、LDH、LAC、BUN和SOD的影响

与阴性和阳性对照组比较,柴胡茎叶总黄酮提取物三个剂量组明显提高运动后小鼠肝糖原、肌糖原水平和运动小鼠LDH活力,降低LAC及BUN含量水平（P＜0.01）。柴胡茎叶总黄酮三个剂量组明显提高运动小鼠SOD活力（P＜0.05）。详见表1。

表1 柴胡茎叶总黄酮提取物对小鼠游泳后肝糖原、肌糖原、LDH、LAC、BUN和SOD的影响Table 1 Effect of Bupleurum stalk and leaf total flavonoids extract on liver glycogen,muscle glycogen,LDH,LAC,BUN and SOD after swimming in mice（n=10,±s）

表1 柴胡茎叶总黄酮提取物对小鼠游泳后肝糖原、肌糖原、LDH、LAC、BUN和SOD的影响Table 1 Effect of Bupleurum stalk and leaf total flavonoids extract on liver glycogen,muscle glycogen,LDH,LAC,BUN and SOD after swimming in mice（n=10,±s）

*P＜0.05,**P＜0.01 compared with negative control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with positive control group.

GroupHepatic glycogen（WB/mg·g-1）LAC（cB/mmol·L-1）Negative control 13.22±0.103.36±0.052957±4376.81±0.26 Positive control25.66±0.296.57±0.934289±4835.99±0.12 Low dose34.35±0.27＊8.19±0.19＊4877±415＊4.92±0.15 Middle dose36.72±0.16＊△8.51±0.16＊4981±462＊＊△4.83±0.14 High dose42.89±0.21＊＊△8.95±0.12＊△△5116±512＊＊△4.79±0.12＊△Muscle glycogen（WB/mg·g-1）LDH（λB/U·L-1）BUN（cB/mmol·L-1）9.13±1.98 8.79±1.46 6.82±0.89＊7.66±1.50 7.25±1.78 SOD（λB/U·mg-1）363.66±27.63 370.17±33.87 453.96±36.11＊477.67±34.95＊△498.36±35.89＊△

2.3 柴胡茎叶总黄酮对小鼠运动耐力的影响

与阴性和阳性对照组比较,柴胡茎叶总黄酮提取物三个剂量组小鼠负重游泳时间明显延长（P＜0.01）,表明柴胡茎叶总黄酮具有提高小鼠耐力作用。详见表2。

表2 柴胡茎叶总黄酮提取物对小鼠负重游泳时间的影响Table 2 Effect of Bupleurum stalk and leaf total flavonoids extract on swimming time of mice（n=10,±s t/min）

表2 柴胡茎叶总黄酮提取物对小鼠负重游泳时间的影响Table 2 Effect of Bupleurum stalk and leaf total flavonoids extract on swimming time of mice（n=10,±s t/min）

*P＜0.05,**P＜0.01 compared with negative control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with positive control group.

GroupLoaded swimming time Negative control96.67±1.07 Positive control115.46±1.15 Low dose129.25±1.19＊△Middle dose133.66±0.93＊△High dose137.49±1.02＊＊△△

3 讨论

通过对比分析后确定柴胡茎叶提取所用溶剂和提取方法。柴胡茎叶总黄酮提取过程中对提取前浸泡时间、料液比和提取时间采用正交方法进行优化设计,这几个因子对柴胡地上部分总黄酮提取率及浸膏得率均有影响,但料液比和提取时间对其提取率和浸膏得率的影响较大。

运动小鼠给予柴胡茎叶总黄酮提取物三个剂量后均能使肝糖原、肌糖原、LDH、LAC、BUN和SOD含量发生变化,并延长小鼠负重游泳时间。在负重游泳实验中,与阴性和阳性对照组比较,柴胡茎叶总黄酮提取物的3个剂量组都能提高运动小鼠运动耐力。肝糖原的作用是输出葡萄糖来补充血糖的消耗,保持血糖的正常水平。血糖作为中枢神经系统的基本燃料,是长时间骨骼肌可动用的必需燃料。糖是肌肉活动时能量的重要来源[7,8]。本研究表明柴胡茎叶总黄酮提取物具有抗疲劳作用,其作用机制可能是柴胡茎叶总黄酮提取物中某些成分促进了脂肪向糖的转化、不断补充运动后血糖的消耗,增加糖元的储备、维持血糖的正常水平从而保护肌细胞膜完整性,保证中枢神经系统、运动肌等组织的糖供给,延缓运动性疲劳的产生[9,10]。