人参-附子体外心衰细胞保护作用配伍研究

王野，刘雪莹，窦德强*，陈飞谷*

(辽宁中医药大学药学院·辽宁大连·116600）

心力衰竭(心衰)是一种复杂的临床症状群,是各种心脏病的严重阶段。根据多年前的流行病学调查,随着老龄化社会的到来,中国心力衰竭患者数量必将呈逐年增长的态势[1]。国际上多用西药对心衰进行治疗,但由于西药治疗常伴随明显的不良反应[2],在国内中医药对于心衰治疗强调整体辩证,在稳定病情、改善心功能、提高生存质量等方面具有优势[3],因此现代中医常利用西医诊断、中医辨证论治的方法对心衰进行治疗[4]。人参附子配伍常在用治疗心衰的方剂中出现,但不同方剂之间人参附子配伍比例存在相当差异,因此本实验对不同配伍比例的人参附子水煎液对体外心衰细胞的保护作用进行研究,对人参附子的不同配伍比例进行筛选,寻找对心衰疗效较好的配伍比例。

1 试验方法及材料

1.1 材料与仪器

1.1.1 动物

出生1～3 d SD大鼠的乳鼠,SPF级,雌雄不限,SD大鼠孕鼠由辽宁长生生物技术有限公司提供（许可证号：SCXK(辽)2015-0001）。

1.1.2 药材

人参药材与附子药材（来源于中国中医科学院）。

1.1.3 试剂

四甲基偶氮唑蓝（MTT）（批号：303H0525；北京Solarbio公司）；二甲基亚砜（DMSO）（批号：520C0313；美国Sigma公司）；高糖DMEM培养基（批号：；美国Gibco公司）；0.25%胰蛋白酶（含EDTA）（批号：1830857；美国Gibco公司）；胎牛血清（批号：8166872；美国Gibco公司）；青、链霉素（批号：J160035；美国Hyclone公司）；PBS磷酸盐缓冲液（批号：113I0215；北京Solarbio公司）；Ⅱ型胶原酶（批号：607C1312；北京Solarbio公司）；D-Hank's液（批号：20170706；北京Solarbio公司）；去乙酰毛花苷注射液（批号：161105；上海禾丰制药有限公司）。

1.1.4 仪器与设备

NU-4750型CO2培养箱（美国NUAIRE公司）；HD2-BCN-1360B生物洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；Caretium酶标仪（深圳市凯特生物医疗电子科技有限公司）；AE31EF型倒置显微镜（Motic公司）；U570-86 Premium系列超低温冰箱（-80℃）（美国NBS公司）；TDZ4-WS低速台式离心机（湘仪离心机）；滤器（0.22μm）（Millex.GP）；细胞培养瓶（Corning公司）；96孔无菌培养板（Corning公司）；6孔无菌培养板（Corning公司）；24孔无菌培养板（Corning公司）；HH-4电子恒温水浴锅（金坛市亿通公司）；BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）；200目孔径不锈钢滤网（北京Solarbio公司）；眼科剪与眼科镊。

1.1.5 主要试剂的配制

10%高糖DMEM培养液：取适量高糖DMEM培养基,并加入1%双抗10%于56℃灭活胎牛血清,0.22μm滤膜过滤,4℃冰箱保存备用。

0.8%戊巴比妥钠：用不含血清的高糖DMEM培养基溶解戊巴比妥钠粉末(现配现用),将浓度稀释为0.8%。

1.1.6 待测物药液的配制

人参药材与附子药材分别用粉碎机粉碎后过60目筛,干燥器中保存备用。

3：1（人参：附子）水煎液：取15g人参粉末与5g附子粉末,加10倍量水浸渍30min,文火煎煮提取1h,静置冷却后,水煎液用200目滤布过滤,滤渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液静置放凉后,滤布过滤,合并两次水煎液滤液,3000r/min离心10min,除去沉淀,上清液减压浓缩定容至100mL（以生药计200mg/mL）即得。分装,置冰箱中-20℃冷冻保存备用。2：1（人参：附子）水煎液：取10g人参粉末与5g附子粉末,加10倍量水浸渍30min,文火煎煮提取1h,静置冷却后,水煎液用200目滤布过滤,滤渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液静置放凉后,滤布过滤,合并两次水煎液滤液,3000r/min离心10min,除去沉淀,上清液减压浓缩定容至100mL（以生药计150mg/mL）即得。分装,置冰箱中-20℃冷冻保存备用。

1.5：1（人参：附子）水煎液：取15g人参粉末与5g附子粉末,加10倍量水浸渍30min,文火煎煮提取1h,静置冷却后,水煎液用200目滤布过滤,滤渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液静置放凉后,滤布过滤,合并两次水煎液滤液,3000r/min离心10min,除去沉淀,上清液减压浓缩定容至100mL（以生药计200mg/mL）即得。分装,置冰箱中-20℃冷冻保存备用。1：1（人参：附子）水煎液：取10g人参粉末与10g附子粉末,加10倍量水浸渍30min,文火煎煮提取1h,静置冷却后,水煎液用200目滤布过滤,滤渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液静置放凉后,滤布过滤,合并两次水煎液滤液,3000r/min离心10min,除去沉淀,上清液减压浓缩定容至100mL（以生药计200mg/mL）即得。分装,置冰箱中-20℃冷冻保存备用。

1：2（人参：附子）水煎液：取5g人参粉末与10g附子粉末,加10倍量水浸渍30min,文火煎煮提取1h,静置冷却后,水煎液用200目滤布过滤,滤渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液静置放凉后,滤布过滤,合并两次水煎液滤液,3000r/min离心10min,除去沉淀,上清液减压浓缩定容至100mL（以生药计150mg/mL）即得。分装,置冰箱中-20℃冷冻保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 心肌细胞的原代培养

取出生1～3 d SD大鼠的乳鼠若干用于实验,超净台下进行以下操作：乳鼠经75%酒精消毒后断头处死,立即使用眼科剪与眼科镊开胸取出心脏,将跳动的心脏在夹持到盛有预冷PBS平衡溶液的无菌EP管中使心脏自动泵出血液,操作过程中尽量注意防止损伤心脏。将心室部分剪下放入D-Hank's液中冲洗3次。将心肌组织转移至离心管中,将心室肌部分用眼科剪剪成1mm3的组织块,然后加入0.25%胰蛋白酶溶液及0.5%Ⅱ型胶原酶按1：1比例混合成消化酶3mL加入已剪碎的心肌组织中,吸管吹打,置于CO2培养箱（37℃,5% CO2,95%空气）中消化5 min,弃去上层混悬液。再次加入消化酶3 mL消化5 min,收集上清液,并加入培养液终止消化。重复消化3次并收集上清液（若心肌组织未消化彻底,可增加消化次数,消化总时间应尽可能小于30 min）。将细胞混悬液经200目孔径不锈钢滤网过滤,离心机离心后,得到心肌细胞,接种于培养瓶中,然后置于CO2培养箱中,差速贴壁1.5 h。取差速贴壁后细胞悬液用台盼蓝染色计算细胞存活率,倒置显微镜下观察细胞状态后将纯化后的细胞悬液种至各规格培养板中,于37℃5% CO2环境中培养,隔天换培养液,待细胞生长成熟(5 d)后,进行实验[5-8]。

1.2.2 药物浓度筛选

取差速贴壁后细胞悬液,每孔100μL接种于96孔板中,当细胞生长成熟(5 d)后,每孔分别加入终浓度为10、5、1、0.5、0.1 mg/mL的比例为1.5（人参）：1（附子）的人参附子水煎液及终浓度为80、40、20、10 mg/mL的去乙酰毛花苷注射液,同时设置阴性对照组（只接种细胞）和空白对照组（不接种细胞,只加培养液）。24 h后,每孔加入10μL浓度为5 mg/mL的MTT,继续在培养箱中孵育4 h,吸出含MTT的培养液,每孔加入100μL的DMSO,震荡10 min,在酶标仪492 nm处检测吸光度（参考波长为630 nm）,并计算细胞增殖抑制率。

增殖抑制率（%）=[（1-（A实验组-A空白对照组）/（A阴性对照组-A空白对照组）]×100%

1.2.3 戊巴比妥钠致心肌细胞心衰模型建立

将0.8%戊巴比妥钠加入到种有心肌细胞的培养板中,作用7 min,得到心衰模型细胞。造模成功标准为:于显微镜下观察心肌细胞,搏动停止,原本梭形两端变细中部变圆,且有脱壁倾向。

1.2.4 药物对心衰模型细胞离子转运相关酶活力的影响

取差速贴壁后细胞悬液接种于6孔板,每孔2mL,按照2.3下操作进行造模,造模成功后,弃去造模液。实验分为以下几组：

①空白对照组；

②模型组；

③阳性（去乙酰毛花苷）对照组（20mg/mL）；

④3：1组（人参：附子0.5mg/mL）；

⑤2：1组（人参：附子0.5mg/mL）；

⑥1.5：1组（人参：附子0.5mg/mL）；

⑦1：1组（人参：附子0.5mg/mL）；

⑧1：2组（人参：附子0.5mg/mL）；

各组分别加入相应的药液,每组3个复孔,每孔1mL。将细胞置于37℃培养箱中孵育1 h,收集细胞:用0.25%EDTA胰酶消化,收集消化液于离心管中用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化,以1000r/min离心5min收集细胞,生理盐水洗2遍以除掉残留的培养液或磷酸缓冲盐溶液,弃上清,留下层细胞,用生理盐水制备106～107/ml的细胞悬液（500μl）,经超声波细胞破碎机破碎细胞后（功率10%,4s/次,间隔8s,重复8～10次）,按超微量ATP酶测试盒说明书进行测定,得到Na+-K+ATPase的活力,同时检测细胞总蛋白浓度。

破碎后按照试剂盒说明书测定细胞Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶与总ATP酶的活力。

1.2.5 细胞培养液中BNP及TNF-α含量的测定

取差速贴壁后细胞悬液接种于24孔板中,每孔1mL,按2.3项下方法分组、造模与给药,每组6个复孔,每孔0.5mL。给药作用1 h后,弃去药液,用PBS清洗细胞1次,然后每孔加入140μL不含血清的高糖DMEM培养基,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h,收集培养液,采用ELISA法按照相关试剂盒说明书测定培养液中脑钠肽(BNP)与肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。

1.2.6 数据处理

使用统计软件SPSS 17.0处理数据,组间均数比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）,结果以均数±标准差（±s）表示

2 实验结果

2.1 细胞形态观察

台盼蓝染色计算细胞存活率达96%。在倒置显微镜下观察,刚接种的心肌细胞尚未贴壁,呈圆形,悬浮于培养液中。培养72h后,心肌细胞已全部贴壁生长,细胞核凸出明显,贴壁后心肌细胞为梭形、菱形或多角形,伸出伪足,出现自发性节律性搏动,详见图1。

图1 造模前心肌细胞（1×200）

戊巴比妥钠造模后的乳鼠心肌细胞搏动停止,原本梭形两端变细中部变圆,且有脱壁倾向,详见图2。

图2 造模后心肌细胞（1×200）

2.2 药物浓度筛选结果

按上述实验方法,得到以下结果。1.5：1（人参：附子）水煎液及去乙酰毛花苷注射液对原代心肌细胞的增殖抑制率如表1所示。

表1 药物浓度筛选结果

高浓度1：1.5比例人参附子水煎液对原代心肌细胞有抑制作用,而0.5 mg/mL与0.1 mg/mL的1：1.5比例人参附子水煎液对原代心肌细胞无抑制作用,因此选取0.5 mg/mL的1：1.5比例人参附子水煎液进行后续实验。阳性药去乙酰毛花苷在20 mg/mL时对原代心肌细胞无抑制作用,故选取20 mg/mL去乙酰毛花苷进行后续实验。

2.3 不同比例人参附子水煎液对心衰模型细胞离子转运相关酶活力的影响

按上述实验方法,得到以下结果。不同比例人参附子水煎液对心衰模型细胞离子转运相关酶活力的影响结果如表2所示。

表2 不同比例人参附子水煎液对心衰模型细胞离子转运相关酶活力影响结果

图3 不同比例人参附子水煎液对心衰模型细胞离子转运相关酶活力影响

由上述实验结果可知,与空白组相比,模型组Na+-K+ATPase活力显著增强（P＜0.01）,Ca2+-Mg2+ATPase活力有下降趋势,总ATPase活力显著降低,心肌收缩力减弱。与模型组相比,阳性药去乙酰毛花苷组能够显著降低由0.8%戊巴比妥钠所致心衰引起的Na+-K+ATPase及总ATPase活力增强,而对Ca2+-Mg2+ATPase活力影响较小。其他各给药组均有逆转由0.8%戊巴比妥钠所致心衰引起的Na+-K+ATPase及总ATPase活力增强的趋势,以2：1、1.5：1与1：1这三个配伍比例作用最显著,具有统计学意义（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01）。

2.4 不同比例人参附子水煎液对细胞培养液中BNP及TNF-α含量影响

按上述实验方法,得到以下结果。不同比例人参附子水煎液对对细胞培养液中BNP及TNF-α含量影响结果如表3所示。

表3 不同比例人参附子水煎液对细胞培养液中BNP及TNF-α含量影响结果

注：*P＜0.05,**P＜0.01与模型组比较；#P＜0.05,##P＜0.01与空白组比较

由上述实验结果可知,与空白组相比,模型组TNF-α及BNP含量显著增加（P＜0.01）。与模型组相比,阳性药去乙酰毛花苷组能够显著降低TNF-α及BNP含量（P＜0.01）。综合BNP与TNF-α数据统计分析可知2：1（人参：附子）组,1.5：1（人参：附子）组及1：1（人参：附子）组对心衰细胞恢复正常水平具有显著疗效（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）。

3 讨论

心力衰竭是由各种心脏疾病导致心功能不全的一种临床综合征,大多指心肌收缩力下降使心排血量不能满足机体代谢的需要,导致器官、组织血液灌流不足,同时出现体循环或肺循环淤血的表现[9]。

Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase是维持细胞内外离子浓度的重要酶[10],目前研究表明,细胞膜内外各离子浓度具有调节心肌细胞收缩力的能力,当心衰发生时,细胞外钙离子含量高于细胞内,心肌收缩力减弱[11]。当心肌组织缺氧、血流动力学改变时均可促使心肌组织合成TNF-α,TNF-α在心肌重塑和心力衰竭的发生与发展中有重要作用,目前研究表明TNF-α可反映心力衰竭的严重程度,是判定心功能及其观察疗效的一项有价值的指标[12]。脑尿钠肽（BNP）主要由心室肌细胞产生,是一种对机体各组织器官的多种生理功能具有调节作用的活性多肽[11]。当心室容量负荷过重、室壁压力增加、心室肌细胞发生损伤、心室肌细胞受牵拉等因素时会导致BNP分泌增多。目前BNP对于早期诊断和鉴别心衰有十分重要的临床价值,也是评估预后、危险层次级别划分、判断治疗心衰效果的“金指标”[13]。

自古以来,人参附子配伍应用与多种方剂方中,如参附汤、人参四逆汤等。目前此类方剂多用于治疗心力衰竭、心源性休克等心血管疾病。但不同方剂中其配伍比例存在差异[14],因此,本实验通过建立体外心衰模型,对不同比例配伍的人参附子水煎液进行优选,结果表明2：1（人参：附子）组,1.5：1（人参：附子）组及1：1（人参：附子）组疗效较好,能够显著降低由心衰引起的TNF-α及BNP水平改变,通过调节心室肌细胞膜上Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase及总ATPase含量,使心肌的收缩性加强,发挥抗心衰作用。