急性髓系白血病患者CD73、DJ-1及LAMP4基因表达及意义

王萍 高红秀 任晓艳 郭力 吴胜胜

作者单位：驻马店市中心医院血液内科，河南，驻马店463000

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）又被称作急性非淋巴细胞白血病或急性粒细胞白血病，是一种较为常见的造血系统恶性增生性疾病，疾病早期患者血细胞数目明显减少，并引发发热、倦怠、食欲减退等症。目前，对于AML的发病机制尚未十分明确，对于急性早幼粒细胞白血病患者通过系统治疗近期生存率较高，而其他AML 患者多病情急重，复发率高，预后差，因而寻找有效评估AML 病情预后的标志物及相关治疗靶点具有重要意义。CD73 为存在于细胞膜上的一类5′-核苷酸酶，与人体正常淋巴细胞的分化、发育有关。近年来研究显示［1］，CD73 与急性白血病、慢性髓系白血病等患者预后存在密切联系。DJ-1基因又被称为PARK7基因，具有抗氧化、抑制细胞凋亡等多种功能，研究证实［2］，DJ-1基因表达与多种恶性肿瘤的发生、侵袭转移及预后相关，可作为恶性肿瘤的诊断及治疗靶点。溶酶体相关膜蛋白（lysosome-associated membrane protein，LAMP）为溶酶体膜蛋白的主要组成成分，其中LAMP4 主要定位于内膜系统，主要参与细胞的吞噬作用、细胞癌变等过程，在恶性肿瘤的诊断和预后研究中应用较广［3］。因此，本研究分析了AML患者CD73、DJ-1及LAMP4基因表达情况，以期为AML 的临床诊断提供有效分子标记及治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取驻马店市中心医院血液内科2018年1月至2020年1月初诊为AML 的70 例患者的骨髓标本作为研究组，纳入标准：①符合《血液病诊断及疗效标准（第3 版）》［4］中的诊断标准；②自愿参与本研究并签署知情同意书；③非APL 患者采用IA方案化疗；④均为初次确诊。排除标准：①合并其他部位肿瘤者；②无法配合研究进行者；③肝肾等脏器功能异常者；④合并其他影响本研究结果的因素。其中，男39 例，女31 例，年龄平均（51.1±3.2）岁，依照FAB 标准［5］分为M0（5 例）、M1（6例）、M2（30 例）、M4（4 例）、M5（19 例）、M6（6例）。另选取10 例于本院行骨髓穿刺检查的非血液系统肿瘤疾病的骨髓捐献者骨髓穿刺标本作为对照组，其中男6 例，女4 例，年龄平均（49.6±3.4）岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本实验经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 临床指标统计

统计所有患者性别、年龄、法国-美国-英国（French-American-British，FAB）白血病分型标准、贫血程度及世界卫生组织（World Health Organization，WHO）疾病危险度分级［6］，并检查血液白细胞、血小板、幼稚细胞组等实验室指标。

1.2.2 CD73、DJ-1及LAMP4mRNA水平检测

采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测CD73、DJ-1及LAMP4基因表达：所有患者入院确诊后立即抽取2 mL 骨髓血，梯度离心20 min 获得1～2×106个骨髓单个核细胞，PBS 洗涤，提取细胞总RNA。采用QuantiNova SYBR Green PCR Kit 试剂盒（购自德国Qiagen 公司）提取总RNA，Quant cDNA 第一链合成试剂盒（购自天根公司）逆转录获取cDNA。CD73、DJ-1及LAMP4 引物均由上海生物工程公司合成。CD73 引物序列，上游：5′-CACCAAGGTTCAGCAGATCCG-3′，下游：5′-GTTCATCAATGGGCGACCGG-3′。DJ-1 引物序列：上游：5′-GTGTAGCCGTGATGTGGTC-3′，下游：5′-GCT CCTTCAGTATCTCCTTCAC-3′。LAMP4 引物序列：上游：5′-GACAAGTACAACGTGAGCGG-3′，下游：5′-CGAGGTCTTGTTGGGGTTGA-3′。内参照β-actin 引物序列，上游：5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游：5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′。荧光定量PCR 扩增获取溶解曲线、扩增曲线，采用2-△△Ct计算CD73、DJ-1及LAMP4基因相对定量表达水平。

1.2.3 预后分析

依照《血液病诊断及疗效标准（第3 版）》［4］中标准定义病人缓解定义为外周血象恢复，骨髓原始细胞＜5%。并根据缓解情况分为未缓解（none remission，NR）、部分缓解（partial remission，PR）和完全缓解（complete remission，CR）。所有患者随访6～36 个月，统计患者预后生存情况，计算生存率和中位生存时间。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以（）表示，两两比较采用t检验，多组间比较采用F检验；计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组和对照组CD73、DJ-1及LAMP4基因表达水平比较

研究组CD73、DJ-1及LAMP4mRNA表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比较（±s）Table 1 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels between 2 groups（±s）

表1 两组CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比较（±s）Table 1 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels between 2 groups（±s）

组别对照组研究组t 值P 值n 10 70 CD73 0.24±0.07 0.77±0.20 16.268 0.000 DJ-1 0.51±0.11 2.52±0.39 34.558 0.000 LAMP4 mRNA 0.28±0.07 0.42±0.09 4.710 0.000

2.2 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 与AML 患者临床特征的相关性

CD73、DJ-1及LAMP4mRNA 表达水平与患者性别、年龄、贫血程度、血小板计数、幼稚细胞计数无相关性（P＞0.05），与疾病危险程度分级、白细胞计数、FAB 分型存在显著相关性（P＜0.05）。见表2。

表2 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 与AML 患者临床特征的相关性（±s）Table 2 Correlation between CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA and clinical characteristics of AML patients mRNA（±s）

表2 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 与AML 患者临床特征的相关性（±s）Table 2 Correlation between CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA and clinical characteristics of AML patients mRNA（±s）

项目性别t 值P 值年龄t 值P 值FAB 分型F 值P 值贫血程度F 值P 值白细胞计数t 值P 值血小板计数F 值P 值幼稚细胞比例t 值P 值疾病危险程度分级F 值P 值男女≤60＞60 M0 M1 M2 M4 M5 M6正常轻中度重度≤50＞50＜50 50～100＞100 0～0.5 0.5～1.0低中高n 39 31 49 21 5 6 3 0 4 1 9 67 49 14 50 20 46 12 12 23 47 21 37 12 CD73 0.78±0.22 0.75±0.20 0.590 0.557 0.76±0.17 0.77±0.23 0.202 0.840 0.64±0.20 0.65±0.22 0.94±0.20 0.63±0.18 0.77±0.23 0.61±0.20 8.699 0.000 0.77±0.22 0.74±0.21 0.79±0.25 0.186 0.854 0.59±0.17 0.83±0.22 4.894 0.000 0.78±0.19 0.72±0.23 0.77±0.23 0.155 0.877 0.76±0.15 0.78±0.26 0.610 0.544 0.52±0.14 0.63±0.18 0.96±0.22 7.041 0.000 DJ-1 2.55±0.43 2.51±0.37 0.411 0.682 2.46±0.47 2.53±0.41 0.592 0.556 2.30±0.29 2.31±0.36 2.96±0.62 2.33±0.35 2.70±0.28 2.25±0.21 9.153 0.000 2.50±0.42 2.53±0.44 2.54±0.41 0.219 0.829 2.33±0.36 3.19±0.47 8.253 0.000 2.51±0.45 2.55±0.51 2.56±0.39 0.387 0.700 2.52±0.44 2.53±0.41 0.094 0.926 2.16±0.24 2.33±0.34 2.98±0.42 6.209 0.000 LAMP4 mRNA 0.42±0.09 0.43±0.08 0.485 0.629 0.40±0.11 0.43±0.09 1.101 0.275 0.43±0.08 0.44±0.12 0.66±0.15 0.55±0.10 0.58±0.13 0.43±0.09 10.314 0.000 0.40±0.07 0.43±0.09 0.41±0.09 0.267 0.792 0.30±0.06 0.52±0.13 7.265 0.000 0.44±0.09 0.44±0.11 0.42±0.08 0.770 0.444 0.41±0.09 0.42±0.13 0.331 0.741 0.25±0.05 0.45±0.06 0.67±0.15 9.405 0.000

2.3 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 与AML 患者治疗效果的相关性

70 例患者经过治疗后完全缓解率为74.3%（52/70），依照AML 患者入院确诊后测定的CD73、DJ-1及LAMP4mRNA 均值为分界线分为低于均值的低表达组和高于均值高表达组并对比显示，CD73、DJ-1及LAMP4 低表达的AML 患者完全缓解率显著高于高表达患者，且治疗缓解后AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 表达较治疗前明显降低（P＜0.05）。见表3～4。

表3 不同CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 表达水平治疗后CR 比较［n（%）］Table 3 Comparison of CR after treatment with different expression levels of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA［n（%）］

2.4 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 与AML 患者预后的相关性

所有患者随访6～36 个月，平均（21.3±2.4）个月，预后良好的AML 患者入院确诊后测定的CD73、DJ-1及LAMP4 较预后不良患者表达水平较低，且CD73、DJ-1及LAMP4 低表达的AML 患者总体生存率及中位生存时间显著高于高表达患者（P＜0.05）。见表5～6。

表5 不同预后的AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比较（±s）Table 5 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels in AML patients with different prognosis（±s）

表5 不同预后的AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比较（±s）Table 5 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels in AML patients with different prognosis（±s）

项目预后良好预后不良t 值P 值n 52 18 CD73 0.48±0.08 0.83±0.12 11.520 0.000 DJ-1 1.96±0.26 2.71±0.47 6.438 0.000 LAMP4 mRNA 0.36±0.10 0.62±0.14 8.538 0.000

表4 治疗缓解前后AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比较（±s）Table 4 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels in AML patients before and after treatment remission（±s）

表4 治疗缓解前后AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比较（±s）Table 4 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels in AML patients before and after treatment remission（±s）

时间缓解前缓解后t 值P 值n 52 52 CD73 0.75±0.08 0.32±0.15 18.240 0.000 DJ-1 2.36±0.26 0.77±0.20 34.954 0.000 LAMP4 mRNA 0.41±0.10 0.31±0.10 5.099 0.012

3 讨论

AML 以造血干细胞/祖细胞异常增殖、分化受阻和凋亡抑制为主要特征的高度异质性血液系统疾病，随着遗传学及分子医学的不断发展，研究显示基因突变、染色体易位及造血细胞免疫表型改变与白血病的发生发展密切相关，对AML 患者的治疗反应和预后均有一定的影响［7］。因此，研究AML 患者相关分子表达对于寻找患者个体化治疗、基因治疗的分子靶点及了解AML 的发生发展分子机理等具有重要意义。

CD73 为分布于多种细胞细胞膜上的一类白细胞抗原，具有磷酸转移酶和水解酶两种酶活性，在维持核苷酸代谢平衡中具有重要作用。近年来报道显示［8］，CD73 与白血病患者治疗预后及分型相关；另有研究证实［9］，AML 患者核苷酸水解酶活性越强，患者白血病相关细胞分化程度越低，预后也越差。DJ-1 基因为新发现的一类丝裂原依赖性癌基因，在胃癌、肝细胞癌等多种实体肿瘤中广泛表达，在调节肿瘤细胞凋亡、促进细胞增殖、转录、侵袭、转移等方面发挥重要作用［10-11］。研究显示在初治急性白血病及骨髓增生异常综合征患者的骨髓标本中DJ-1基因表达水平明显增加［12］。溶酶体为细胞质中重要的细胞器，参与了细胞免疫、代谢、自噬等生理过程，LAMP4 为主要定位于溶酶体的巨噬细胞表面分子标记物，可能通过调节AML 细胞的凋亡抑制和分化阻滞参与疾病的发生发展。研究指出［13］，LAMP4 在胃癌、乳腺癌等恶性肿瘤组织中高表达，并与恶性肿瘤患者临床病理特征存在密切关系。本研究结果显示，在AML 患者骨髓标本中CD73、DJ-1及LAMP4mRNA 表达水平明显高于正常人群的骨髓标本。研究结果CD73、DJ-1及LAMP4mRNA 表达水平与AML 患者临床特征、疾病发展有着显著关系，可能为AML 发生发展的危险因素，这与一些研究的结果相类似［14-16］。

表6 不同CD73、DJ-1及LAMP4 表达水平AML 患者总体生存率及中位生存时间比较Table 6 Comparison of overall survival rate and median survival time of AML patients with different expression levels of CD73，DJ-1 and LAMP4

本研究结果还显示，CD73、DJ-1及LAMP4低表达的AML 患者完全缓解率显著高于高表达患者，且治疗缓解后AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4表达较治疗前明显降低。同时，预后良好的AML患者CD73、DJ-1及LAMP4较其他患者表达水平较低，且CD73、DJ-1及LAMP4低表达的AML 患者总体生存率及中位生存时间显著高于高表达患者。因此，AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4表达水平越高，患者治疗效果及预后越差，而抑制CD73、DJ-1及LAMP4表达可延长患者生存时间，提升患者生存率。因而检测CD73、DJ-1及LAMP4表达有助于AML 患者的诊断和预后判断，但其具体的机制尚需进一步深入探讨。综上所述，AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4呈高表达，结合患者临床特征及治疗前后三指标表达变化有助于判断患者预后，并为临床治疗提供参考。