人类白细胞抗原基因分型检测试剂盒行业标准的修订与验证

胡泽斌 王瑞霞 代蕾颖 曲守方★ 黄杰★

作者单位：1.中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所，北京100050

2.北京市医疗器械检验研究院，北京101111

人类白细胞抗原（Human Leucocyte Antigen，HLA）的I 类A、B、C 位点和II 类DR、DQ 位点等位基因的分型检测在造血干细胞移植，骨髓移植以及肝脏肾脏等其他组织器官移植的供体受体配型中发挥关键作用［1-2］。同时HLA-I 类B 座位的单位点如B27 和B5801 等基因分型检测在强制性脊柱炎的辅助诊断和痛风用药指导中也发挥重要作用［3-4］。目前，在国家药品监督管理局取得医疗器械注册证的HLA 基因分型检测试剂盒约有十种，方法学包含聚合酶链反应-序列特异性引物法（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）、聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针法（polymerase chain reaction- sequence specific oligonucleotide，PCR-SSO）、基因测序分型法（sequence based genotyping，PCR-SBG）、荧光PCR 法等［5-7］。2010年原国家食品药品监督管理局发布的行业标准YY/T 1180-2010《人类白细胞抗原（HLA）基因分型试剂盒（SSP 法）》［8］，为分子诊断领域较早制定的产品标准，仅针对当时较为流行的SSP 方法学的HLA 基因分型试剂盒，随着HLA产品多样性的增加，原条款适用性降低，按照国家药品监督管理局2020年医疗器械行业标准制修订计划［9］，对其进行修订。本研究选取16 批次不同方法学的HLA 基因分型试剂盒，对拟定标准的技术指标和检验方法进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 核酸分型检测试剂盒（PCR-SBT 法），由德必碁生物科技（厦门）有限公司提供；HLA-A、B、C、DR、DQ 位点分型检测试剂盒（SSO 法），由北京博富瑞基因诊断技术有限公司提供；人类白细胞抗原B*5801 核酸检测试剂盒（荧光PCR 法），人类白细胞抗原B*1502 核酸检测试剂盒（荧光PCR 法），人类白细胞抗原B*27 基因分型试剂盒（SSP 法），由江苏伟禾生物科技有限公司提供；HLA-B27 基因检测试剂盒（荧光PCR 探针法），由山东英盛生物技术有限公司提供；人类白细胞抗原B27 核酸检测试剂盒（荧光PCR 法），由江苏默乐生物科技股份有限公司提供；HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 位点分型检测试剂盒（SBT 法），HLA-A、B、C、DR、DQ 位点分型检测试剂盒（SSP 法），HLA-A、B、C、DR、DQ 位点分型检测试剂盒（SSO 法），由赛默飞世尔科技（中国）有限公司提供。人类白细胞抗原B27 核酸检测国家参考品（批号：360035-201901，10 支/套，30 μL/支，20 ng/μL），由中国食品药品检定研究院提供；人类白细胞抗原B5801/5701/1502 核酸检测国家参考品（批号：360036-201901，20 支/套，30 μL/支，20 ng/μL），由中国食品药品检定研究院提供；人类白细胞抗原组织配型基因分型国家参考品（批号：360045-202001，38 支/套，30 μL/支，20 ng/μL），由中国食品药品检定研究院提供。

1.1.2 仪器

ABI 7500 荧光定量基因扩增仪由中国食品药品检定研究院提供；ABI GeneAmpPCR System，上海天能凝胶成像仪，由江苏伟禾生物科技有限公司提供；luminex200 多功能流式点阵仪由北京博富瑞基因诊断技术有限公司提供；ABI 3730XL 分析仪由德必碁生物科技（厦门）有限公司提供；SLAN-96P 全自动医用PCR 分析系统由江苏默乐生物科技股份有限公司提供；Thermofisher DNA分析仪，Alpha Imager 凝胶成像系统由赛默飞世尔科技（中国）有限公司提供。

1.2 方法

按照修订后的行业标准《人类白细胞抗原（HLA）基因分型试剂盒》进行验证。验证的技术指标包括外观、参考品符合率、重复性、有效检测范围、稳定性、准确性、特异性、检出限。

1.2.1 外观

目测检查外观，包括试剂盒的完整性、效期、包装信息、是否有人为损伤。

1.2.2 与移植或输血的供体与受体匹配相关试剂盒的性能要求

1.2.2.1 参考品符合率 对HLA 基因分型国家参考品或者企业参考品进行检测，应与已知基因分型结果相符合。

1.2.2.2 重复性 将1～3 份具有代表性的DNA 样品进行检测，每份样品平行检测3～5 次，检测的结果应一致且与已知基因分型结果相符合。

1.2.2.3 有效检测范围 用试剂盒检测范围内的阳性参考品，分别配制出最高和最低两个浓度进行检测，均应与已知基因型别相符合。

1.2.2.4 稳定性 可选用效期稳定性或热稳定性试验进行参考品符合率和有效检测范围项目的验证。

1.2.3 疾病辅助诊断相关试剂盒的性能要求

1.2.3.1 准确性 对试剂盒检测范围内已知基因分型的国家或企业阳性参考品进行检测，结果应为阳性或相应基因型。

1.2.3.2 特异性 对试剂盒检测范围外的国家或企业阴性参考品进行检测，检测结果应为阴性或未检出。

1.2.3.3 重复性 对1～3 份阳性参考品平行进行检测5～10 次，结果应均为阳性或相应基因型；对1～3 份阴性参考品平行进行检测5～10 次，结果应均为阴性或未检出。

1.2.3.4 检出限 对检出限参考品进行检测，结果应为阳性或相应基因型。

1.2.3.5 稳定性 可选用效期稳定性或热稳定性试验进行准确性、特异性、检出限、4 项目的验证。

2 结果

2.1 外观验证结果

对6 家共16 批次HLA 基因分型检测试剂盒，依据拟定HLA 行业标准的上述性能指标进行了全部验证，所有试剂盒的各组份齐全、完整，液体无渗漏；包装标签应清晰，无磨损，外观均符合行业标准规定。

2.2 与移植或输血的供体与受体匹配相关试剂盒的性能验证结果

2.2.1 参考品符合率验证结果

3 家企业的HLA-A、B、C、DR、DQ 位点分型检测试剂盒（SBT 法和SSO 法）对人类白细胞抗原组织配型基因分型国家参考品的38 支人基因组DNA 样品，全部进行参考品符合率检测，在制造商宣称的分辨率水平上，验证结果与国家参考品已知基因分型结果相符合，结果均符合规定。

2.2.2 重复性和有效检测范围验证结果

采用2 种方法学的HLA-A、B、C、DR、DQ 位点分型检测试剂盒（SSP 法和SSO 法），对3 份已知基因分型的具有代表性的重复性参考品进行检测，每份样品平行检测3 次，检测结果应一致，且在制造商宣称的分辨率水平上与已知基因分型结果相符合。

对2 份试剂盒检测范围内已知基因分型的企业阳性参考品，分别配制出高、低2 个浓度后进行检测，结果均在试剂盒制造商宣称的分辨率水平上与已知基因型别相符合。

2.2.3 稳定性验证结果

采用2 种方法学的HLA-A、B、C、DR、DQ 位点分型检测试剂盒（SSP 法和SSO 法）对效期稳定性进行验证，参考品符合率和有效检测范围均符合拟定行业标准的要求，见表1。

表1 与移植或输血的供体与受体匹配相关试剂盒的部分验证结果Table 1 Partial verification results of related kits matched with donors and recipients for transplantation or blood transfusion

2.3 疾病辅助诊断相关试剂盒的性能验证结果

2.3.1 HLA-B27 基因检测试剂盒的性能验证结果

采用3 家共4 批次HLA-B27 基因检测试剂盒（荧光PCR 法和SSP 法），对人类白细胞抗原B27核酸检测国家参考品的10 支人基因组DNA 样品全部进行了准确性和特异性检测，试剂盒检测范围内已知基因分型的国家阳性参考品检测结果均阳性或相应基因型。

试剂盒检测范围外的国家阴性参考品的检测结果均为阴性；同时对2 家的企业阳性参考品和企业阴性参考品进行检测，结果全部符合规定；重复性和检出限项目中，采用2 家2 批次HLA-B27 基因检测试剂盒（荧光PCR 法），对阳性重复性参考品平行进行检测10 次，结果一致均为阳性，对阴性重复性参考品平行进行检测10 次，结果一致应均为阴性，对检出限参考品进行检测结果均检出阳性；稳定性项目中，采用2 家2 批次HLA-B27 基因检测试剂盒（荧光PCR 法），对效期稳定性进行验证，准确性、特异性和检出限均符合拟定行业标准的要求，见表2。

表2 疾病辅助诊断相关试剂盒的部分验证结果Table 2 Partial verification results of related kits for auxiliary diagnosis of diseases

2.3.2 HLA-B1502 和B5801 基因检测试剂盒的性能验证结果

在疾病辅助诊断相关试剂盒的性能要求中，采用1 家各1 批次的HLA-B1502 和B5801 试剂盒（PCR 法），对人类白细胞抗原B5801/5701/1502 核酸检测国家参考品的20 支人基因组DNA 样品全部进行了准确性和特异性检测，试剂盒检测范围内已知基因分型的国家阳性参考品检测结果均为阳性；试剂盒检测范围外的国家阴性参考品的检测结果均为阴性；重复性和检出限项目中，还采用1 批次HLA-B5801 试剂盒，对阳性重复性参考品平行进行检测10 次，结果一致均为阳性，对阴性重复性参考品平行进行检测10 次，结果一致应均为阴性，对检出限参考品进行检测结果均检出阳性；稳定性项目中，还采用1 批次HLA-B5801 试剂盒对效期稳定性进行验证，准确性、特异性和检出限均符合拟定行业标准的要求。

3 讨论

随着体外诊断分子检测技术的飞速发展和对HLA 科学研究的不断深入，临床上涌现出更多更丰富的HLA 基因分型试剂盒。从临床预期用途来说，此类试剂盒主要有两大类，一类是用于组织器官和干细胞移植供受体配型的A、B、C、DRB、DQB 位点的HLA 分型试剂，方法学上有低分辨率、中分辨率的SSP 法和SSO 法，还有高分辨率的SBT 法；另一类是用于疾病辅助诊断或临床用药指导的HLA 单位点核酸检测试剂盒［10-11］，如与强制性脊柱炎密切相关的B27，与治疗痛风常用药别嘌呤醇过敏相关的HLA-B5801，与抗艾滋病经典药物阿巴卡韦超敏反应相关的HLA-B5701，与抗癫痫药卡马西平药物引起的史蒂芬琼森症候群相关的HLA-B1502 等基因检测，这类试剂盒在方法学上主要以PCR 为主，包括荧光PCR 法、PCR 探针法、PCR 熔解曲线法等。

原行业标准YY/T 1180-2010 人类白细胞抗原（HLA）基因分型试剂盒（SSP 法）于2010年12月27日发布并于2012年6月1日实施，仅适用于SSP法检测HLA 基因分型试剂盒，而该方法学的试剂盒主要用于HLA的I类A、B、C位点和Ⅱ类DRB、DQB位点的低分辨率、中分辨率的基因分型。为拓展行业标准的适用范围，提高各类HLA 基因分型检测试剂的产品质量，更好满足监管需要，本次修订标准时，根据HLA基因分型产品临床预期用途和性能指标的不同，对产品指标做了分类。在技术指标的确定方面，参考了目前市场上进口企业和国产企业厂家相关产品的说明书和性能评估资料，并结合临床要求制定，业内专家对逐条性能指标进行了充分讨论。并且对标准中每一条性能指标和试验方法均进行了实验验证，关键指标准确性和特异性采用了相应的HLA国家参考品［12-14］进行考察，如上所述，验证结果全部符合标准规定的要求。综上，修订后的HLA 产品标准所列技术指标是合理的，所列试验方法是可靠的可行的。