葡萄糖上调胰腺β细胞CFTR表达而升高胰岛素水平在2型糖尿病中的作用*

赵心怡， 吴 勇▲， 黄文庆， 张雪莲， 郭景慧△

（1暨南大学基础医学与公共卫生学院生理系，广东广州510632；2南方医科大学深圳医院输血科，广东深圳518000；3北京同仁医院内分泌科，北京100005）

糖尿病是一种血糖水平异常升高的慢性代谢疾病，全球超过4 亿人患有糖尿病，其中2 型糖尿病占90%［1］。与1 型糖尿病中胰岛素绝对缺乏不同的是，2 型糖尿病特征为胰岛素相对缺乏和胰岛素抵抗。胰岛素抵抗即靶器官对胰岛素的敏感性降低，对正常浓度的胰岛素反应不足，致使机体血糖浓度处于持续高的水平［2］。2 型糖尿病的成因与诸多因素有关，十分复杂，人们普遍认为高能量的西式饮食加上久坐不动的生活方式是2 型糖尿病的主要原因，除此之外可能还与睡眠和精神等因素有关［3］。与1 型糖尿病相反的是，2型糖尿病患者的胰岛素绝对水平不低反高，过去曾认为2 型糖尿病患者中的高胰岛素水平是胰岛素抵抗的代偿结果，最近有研究表明异常高的胰岛素也可能是胰岛素抵抗的驱动因素［4］。

囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）是白种人人群中常见的常染色体隐性致死性疾病，是由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CF transmembrance conductance regulator，CFTR）基因突变引起的，其重要的并发症之一就是CF 相关糖尿病（cystic fibrosis-related diabetes，CFRD），研究显示，CFTR突变患者其胰岛功能受损、胰岛素分泌不足［5-6］。近年来，有研究证明CFTR 是介导胰岛素释放的关键离子通道，CFTR 调节胰腺β细胞中葡萄糖诱导的胰岛素分泌［7］。

目前普遍认为CFTR突变会导致胰岛素分泌不足进而导致糖尿病，但这不能解释2 型糖尿病中经常伴随着的高胰岛素血症。在该项研究中，我们将探索长时间高葡萄糖暴露对胰腺β 细胞本底胰岛素释放的影响，并且通过临床中正常人群与2 型糖尿病患者的血液样本，验证葡萄糖与CFTR是否存在相互关系，进而为寻找2 型糖尿病胰岛素抵抗发生病因与其治疗方案提供参考。

材料和方法

1 动物和细胞系

大鼠胰腺β 细胞系RINm5F（CRL11605™）购于American Type Culture Collection（ATCC）。SPF 级C57BL/6小鼠来自香港中文大学实验动物服务中心，所有动物实验均按照香港中文大学动物实验管理条例和守则进行，所有相关程序均获得大学动物伦理委员会批准。

2 主要试剂与仪器

2.1 细胞培养试剂 RPMI-1640 培养液（Catalog#11875101）、无 糖 RPMI-1640 培 养 液（Catalog#11879020）、葡萄糖溶液（Catalog# A2494001），胎牛血清（Catalog#16000044）、青霉素-链霉素双抗（Catalog# 15140122）、胰 蛋 白 酶 -EDTA（Catalog#25200072）和磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS；Catalog# 10010031）均购自Thermo、Invitrogen或Gibco。

2.2 主要试剂 XI 型胶原酶（Catalog# 7657）购自Sigma；RNA提取试剂盒（Catalog#9767）、逆转录试剂盒（Catalog# RR036A）和TB Green®Premix Ex Taq™（Catalog# RR420A）均购自 TaKaRa；RIPA（Catalog#89901）、蛋白酶抑制剂（Catalog# 78438）和BSA 蛋白测定试剂盒（Catalog# 23227）均购自Thermo Fisher Scientific；胰岛素酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（Catalog# 10-1248-10）购自 Mercodia；CFTR ELISA 试剂盒（Catalog#LS-F21167-1）购自LifeSpan BioSciences。

2.3 主要仪器 37 ℃恒温细胞培养箱（310TS，Thermo Scientific）；高速冷冻离心机（75002404，Thermo Scientific）；C1000 触 摸 式 热 循 环 仪（1851148，Bio-Rad）；CFX96 实时 PCR 仪（1855195，Bio-Rad）；电泳仪（MP-250V，Major Science）；半干转转印系统（PB0012，Thermo Scientific）；化学发光成像仪（17001402，Bio-Rad）。

3 主要方法

3.1 细胞培养 RINm5F细胞培养于添加了10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640 培养液中。细胞置于含5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培养。

3.2 小鼠原代胰岛分离 成年的C57BL/6 雄性小鼠被安乐死后，通过胆管将含0.8 g/L 的XI型胶原酶的HBSS 从胆管部位注射到胰腺中。取出胰腺并在37 ℃下孵育7 min，150×g离心8 min，并用HBSS清洗3 遍，然后转移到带有培养液的150 mm 培养皿中。显微镜下挑取状态良好的胰岛并转移至干净的带有培养液的培养皿中，置于细胞培养箱中培养或使用。

3.3 细胞系或原代胰岛的长时间葡萄糖处理 处理前更换细胞培养液为添加10%胎牛血清和1%双抗的无糖RPMI-1640 培养液，并根据实验设计在无糖RPMI-1640 培养液中添加葡萄糖溶液至不同的葡萄糖浓度，处理一段时间后收集并提取细胞总RNA或蛋白用于后续检测。

3.4 RT-qPCR 根据说明书，用RNA 提取试剂盒提取细胞或组织的RNA，用逆转录试剂盒和C1000触摸式热循环仪逆转录1 μg RNA，再取逆转录后的0.8 μL cDNA、10 μmol/L 正、反向引物、5 μL TB Green Premix Ex Taq 和适量的纯水（总体积 10 μL）在CFX96 实时荧光定量PCR 仪上按以下程序进行反应：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39（或40）个循环。大鼠CFTR 正向引物序列为5′-GAATCAGTGCAAGTGACTGCG-3′，反 向 引 物 序 列 为 5′-GACTTCACCCTGC-TTTCACG-3′；GAPDH 正向引物序列 5′-GATGCTGGTGCTGAGTATGTCGTG-3′，反向引物序列为5′-TGCATTGCTGACAATCTTGAGGG-3′。3.5 Western blot 实验 用含1%蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，用BCA 法测定蛋白浓度，经过电泳、转膜、封闭、孵育Ⅰ抗、孵育Ⅱ抗的步骤最后用化学发光成像仪曝光，得到清晰的条带图片，并用ImageJ进行灰度值统计分析。

3.6 ELISA 将RINm5F 细胞种于24 孔板，在添加了10%胎牛血清和1%双抗的无糖RPMI-1640 培养液中添加葡萄糖溶液分别至葡萄糖浓度为0、10、20和30 mmol/L，处理RINm5F 细胞24 h，用不含血清和葡萄糖的培养液饥饿细胞2 h，再收集10 mmol/L 葡萄糖刺激下细胞释放的上清液，按照试剂盒厂家说明书进行ELISA。

3.7 临床样本采集和分析 本研究招募了2015 年7 月～2016 年 9 月在北京同仁医院体检的 20～80 岁人群共278 人，根据症状、血糖和胰岛素检测及病史，诊断为2 型糖尿病146 人，非糖尿病132 人。所有程序均经北京同仁医院伦理委员会（TRECKY2014-023）批准，并获得所有参与者的书面知情同意。对受试者采集的信息汇总见表1、2。

表1 男性受试者临床特征Table 1. Clinical characteristics of male subjects（Mean±SEM）

3.8 临床样本血液中CFTR 的测量 用肝素管收集受试者少量静脉血，300×g离心，取上清，按照CFTR ELISA 试剂盒厂家说明书对血样中的CFTR 含量进行测定。

表2 女性受试者临床特征Table 2. Clinical characteristics of female subjects（Mean±SEM）

4 统计学处理

实验数据均釆用GraphPad Prism 9 软件进行统计分析。组间两两比较采用独立样本t检验。每组数据均重复3 次及以上，以均数±标准误（mean±SEM）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

实验中的相关性分析采用Prism 9.0 版中的相关性分析（correlation），r代表相关系数，P代表显著性，以P＜0.05为相关性有统计学意义。

结 果

1 长时间的葡萄糖暴露上调大鼠胰腺β 细胞中CFTR的mRNA水平

我们检测了不同浓度的葡萄糖暴露对大鼠胰腺β 细胞系 RINm5F 中 CFTR mRNA 水平的影响。结果显示，无论是处理24 h 还是48 h，与未暴露在葡萄糖中的RINm5F细胞相比，长时间暴露在不同浓度的葡萄糖中均上调了RINm5F 细胞CFTR 的mRNA 水平表达（P＜0.05），见图1。

2 长时间的葡萄糖暴露上调小鼠原代胰岛CFTR的mRNA水平

Figure 1. Relative mRNA level of CFTR in RINm5F cells exposed to various concentrations of glucose. A：relative mRNA level of CFTR in RINm5F cells treated with 0，10，20 and 30 mmol/L glucose for 24 h；B：relative mRNA level of CFTR in RINm5F cells treated with 0，10，20 and 30 mmol/L glucose for 48 h. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs 0 mmol/L group.图1 暴露于不同浓度葡萄糖下的RINm5F细胞中CFTR的mRNA水平

为了进一步验证上述现象，我们从C57BL/6 小鼠的胰腺中原代分离胰岛并检测了长时间的葡萄糖暴露对其CFTR 的mRNA 水平影响。结果显示，72 h后，与未暴露在葡萄糖中的小鼠胰岛相比，暴露在30 mmol/L 葡萄糖中的胰岛CFTR 的mRNA 表达水平显著上升（P＜0.01），见图2。

3 长时间的葡萄糖暴露上调大鼠胰腺β 细胞中CFTR的蛋白表达

随后我们验证了长时间的葡萄糖暴露对RINm5F细胞中CFTR蛋白表达的影响。Western blot结果显示，与未暴露在葡萄糖中的RINm5F 细胞相比，暴露在葡萄糖中的RINm5F 细胞中CFTR 的蛋白表达显著上调（P＜0.01），见图3。

4 长时间暴露于葡萄糖中可致大鼠胰腺β 细胞本底胰岛素释放增加

为了探究长时间暴露于葡萄糖引起的CFTR 表达的上调是否进一步影响胰岛β 细胞释放胰岛素的能力，我们检测了长时间暴露于葡萄糖后RINm5F细胞的胰岛素释放水平。结果显示，与未暴露于葡萄糖的RINm5F 细胞相比，长期暴露于20 和30 mmol/L葡萄糖后的RINm5F细胞再次响应10 mmol/L的葡萄糖时，其胰岛素分泌显著增加（P＜0.05），见图4。

Figure 2. Relative mRNA level of CFTR in primarily isolated mouse pancreatic islets exposure to various concentrations（0，10 and 30 mmol/L）of glucose for 72 h.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs 0 mmol/L group.图2 暴露于不同浓度葡萄糖下的小鼠原代胰岛CFTR 的mRNA水平

Figure 3. Relative protein level of CFTR in RINm5F cells exposed to various concentrations of glucose. The expression of CFTR in RINm5F cells treated with 0，5，10，15，20 and 30 mmol/L glucose for 48 h was determined by Western blot. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 mmol/L group..图3 暴露于不同浓度葡萄糖下的RINm5F细胞中CFTR的蛋白水平

Figure 4. Basal insulin level in RINm5F cells（1×106 cells）exposed to various concentrations（0，10，20 and 30 mmol/L）of glucose for 24 h. The insulin secretion was determined by ELISA. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs 0 mmol/L group.图4 暴露于不同浓度葡萄糖24 h 后RINm5F 细胞的本底胰岛素水平

5 临床样本中患者的空腹血糖与血浆中的CFTR蛋白水平之间呈正相关

我们对采集到的临床样本的空腹血糖和血浆中CFTR 蛋白水平进行相关性分析，结果显示，非糖尿病患者的空腹血糖和血浆中CFTR 蛋白水平之间没有显著的相关性（r=-0.059，P=0.658）（r=0.115，P=0.333）（图5A、5C），而在女性2型糖尿病患者中两者存在显著正相关关系（r=0.287，P＜0.05）（图5 B），尽管在男性患者中并未看到此相关关系（r=0.009，P=0.930）（图5D），但总体样本的空腹血糖与血浆中CFTR 的蛋白水平仍然显著正相关（r=0.314，P＜0.01）（图5E）。

讨 论

1 型糖尿病和2 型糖尿病（以前又称为“胰岛素依赖型”和“非胰岛素依赖性”糖尿病［8］）是糖尿病最主要的两大分类。1型糖尿病是一种自身免疫疾病，其特征是产生胰岛素的胰腺β 细胞被破坏［9］；而β 细胞功能障碍和胰岛素抵抗是2 型糖尿病的主要特征［10］。胰岛素抵抗是指靶细胞或整个生物体对其所暴露的胰岛素浓度的反应性降低，当胰岛素水平相对于葡萄糖水平高于预期时就会出现这种情况，因此胰岛素抵抗往往与高胰岛素血症有关［4］。以往普遍认为高胰岛素血症是胰岛素抵抗的代偿结果，但有研究表示，用额外拷贝的胰岛素基因转染的小鼠表现出胰岛素抵抗，且胰岛素抵抗的严重程度是由胰岛素过表达的转基因小鼠的基础胰岛素浓度适度升高（2 倍）引起的，而在2 型糖尿病相关的胰岛素抵抗患者中，基础胰岛素水平的两倍升高很常见［4］。

那么2 型糖尿病患者体内异常升高的基础胰岛素水平作为胰岛素抵抗的驱动因素又是由何引起的呢？前言中已经提到，高能量的西式饮食加上久坐不动的生活方式是2 型糖尿病的主要原因，其中，不健康的饮食主要包括增加的精致谷物、红肉或加工肉类和含糖饮料的摄入，这些也是近年来2 型糖尿病流行的主要原因［11］。胰岛素是由体内的葡萄糖浓度水平驱动的，胰岛素和胰高血糖素共同发挥着维持机体血糖平衡的重要作用［12］。因此，高糖和生糖饮食必然会导致机体持续高水平的胰岛素分泌。这可能解释了2 型糖尿病的生活习惯诱因和胰岛素抵抗这一病理现象的关系。

关于葡萄糖诱导胰岛素分泌的机制，2014 年，Guo等［7］报道了CFTR 调控葡萄糖诱导的电活动和胰岛素分泌，抑制β 细胞中的CFTR 或敲低CFTR可以消除或减少葡萄糖引起的膜去极化、钙振荡和胰岛素分泌。除此之外，Ntimbane 等［13］也报道了药理CFTR 抑制剂会阻碍正常β 细胞系中的胰岛素释放，但对CFTR敲除细胞几乎没有影响。因此，CFTR 在β细胞去极化和胰岛素释放中起重要作用。CFTR全称为囊性纤维化跨膜电导调节剂，是一种cAMP调节的氯离子通道，它可以水解和传导ATP，调节囊泡运输和许多顶膜相关通道，以及调节碳氢酸盐释放、降低分泌物pH 值得作用，尤其是在胰腺、十二指肠、回肠和肺中［14-17］。CFTR的突变和功能丧失是导致CF的致病因素，而CF 肺外最主要的并发症就是糖尿病，40%～50% 的成年 CF 患者患有 CFRD［18］，大多数CFTR基因突变患者表现出胰岛素分泌不足［19-20］，多种证据表明CFTR 对于胰腺及胰腺β 细胞分泌胰岛素十分重要。

Figure 5. Correlation analysis between fasting blood glucose and plasma CFTR protein levels in clinical samples. The results of correlation analysis between fasting glucose and plasma CFTR protein levels in female non-diabetic group（A，n=59），female type 2 diabetic group（B，n=54），male non-diabetic group（C，n=73），male type 2 diabetic group（D，n=92）and total samples（E，n=278）were shown. Correlation analysis was conducted with Prism 9.0.图5 对临床样本的空腹血糖与血浆中CFTR蛋白水平的相关性分析

然而以往的研究只强调了CFTR的突变或抑制会减少胰岛素的分泌，这只能解释胰岛素缺乏导致的糖尿病，并不能解释2 型糖尿病患者中出现的高胰岛素血症，且把2 型糖尿病的高胰岛素血症归因于胰岛素抵抗的代偿，虽然有研究者颠覆性地提出了高胰岛素血症可能是胰岛素抵抗的驱动因素［4］，但并未探讨引起糖尿病患者胰岛素水平异常高的因素和分子机制。我们的研究显示，长时间暴露于葡萄糖环境会上调大鼠胰腺β 细胞CFTR 的mRNA 及蛋白水平，并且会升高其本底胰岛素分泌。有趣的是，在葡萄糖处理24 h 与48 h，RINm5F 细胞中的CFTR 在 mRNA 水平以及 48 h CFTR 的 mRNA 水平与蛋白水平在趋势中并不完全一致，这让我们猜想葡萄糖调控CFTR表达水平可能存在时间依赖的机制，在今后的工作中，我们将对葡萄糖调控CFTR表达水平的分子机制进行探索。除了在细胞水平我们验证了葡萄糖升高CFTR的表达水平，进而调控胰岛素的本底释放水平外，我们在2 型糖尿病患者的临床样本中也观察到其空腹血糖与CFTR 的蛋白水平呈显著的正相关，这为2 型糖尿病的病因和特征之间提出了新的可能性，即不良饮食和生活习惯导致的体内持续的高糖水平诱导其胰腺β 细胞CFTR 表达上升，进而导致胰岛素基础释放异常过度产生高胰岛素血症，最终导致胰岛素抵抗这一典型的2 型糖尿病特征。

综上所述，本研究不仅在体外实验中从RNA 水平、蛋白水平和胰岛素释放等多方面证明了葡萄糖上调CFTR表达导致胰岛素分泌增加，研究结果也在临床样本中得到了验证。