毛蕊异黄酮改善2型糖尿病模型大鼠的糖脂代谢紊乱和代谢相关脂肪性肝病症状*

侯瑞英， 吴冬梅， 焦伟杰， 汪 坤， 杜 蕾， 吴桂月， 韩 竞， 赵 旭

（河南省中医院药学部，河南郑州450002）

近些年，由营养过剩造成的代谢相关疾病的发病率呈现急剧上升趋势［1］。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）和非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）均是常见的代谢性疾病，且二者关系密切。二者通常共存，约60%～70%的T2DM 患者中发生肝脂肪变性，特别是腹型肥胖T2DM 患者可高达 100%［2］；约 40% 的 NAFLD 患者同时患有 T2DM［3］。T2DM 不仅是导致 NAFLD 发病的危险因素之一，且其能加快NAFLD 进展至非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），并增加发生肝硬化和肝细胞癌的患病风险［4］；另外，在发生肝脂肪变性的T2DM 患者中，加剧的胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）使得T2DM 患者的血糖更难控制，从而增加糖尿病并发症的患病风险［5］。目前，关于T2DM 和NAFLD 的管理策略均包含降糖、降脂、胰岛素增敏剂、减肥、控制饮食和有氧运动等［6-7］。但，二者共存使的疾病的进展更加复杂，造成这些策略的有效性明显降低。因此，研究T2DM 和NAFLD特别是二者合并症的治疗策略尤为紧迫。

毛蕊异黄酮（calycosin，CAL）是黄芪中一种具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和调节糖脂代谢等药理活性的异黄酮化合物［8］。已有研究表明，CAL能通过抑制炎症并增强胰岛β 细胞功能，来减轻妊娠糖尿病［9］。而，CAL 在T2DM/NAFLD 合并症模型大鼠中的作用及其机制尚不清楚。因此，本研究通过高糖-高脂饮食诱导并联合链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）注射的方法建立T2DM 模型大鼠，观察CAL 干预对NAFLD的影响，并探讨其潜在的作用机制。

材料和方法

1 实验材料

1.1 实验动物 45 只 6 周龄 SPF 级雄性 SD 大鼠（180～190 g）购于河南省动物实验中心［（生产许可证号为SCXK（豫）2017－0001］，饲养于河南省中医院SPF 级动物房。动物实验的所有相关过程均得到本单位动物伦理委员会批准。

1.2 实验试剂（盒）与抗体 STZ 和CAL 购自Sigma；丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）试剂盒及大鼠 IL-6、IL-1β 和 TNF-α ELISA 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；大鼠血糖和胰岛素ELISA 试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司；HE 试剂盒、油红O试剂盒和HRP 偶联的山羊抗兔IgG II 抗购自北京索莱宝生物科技有限公司；Lamin B1 和β-actin 购自武汉博士德生物工程有限公司；Trizol 试剂、RIPA 缓冲液、细胞核/质蛋白分离试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒和ECL 试剂均购自上海碧云天生物科技有限公司；核因子 κB p65（nuclear factor-kappa B p65，NF-κB p65）、胰岛素受体底物 1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）、p-IRS-1（Ser307）、AKT 和 p-AKT（Ser473）抗体均购自CST。

2 实验方法

2.1 模型构建和实验方案 SD 大鼠在给予特殊饮食之前，先用普通饲料（normal chow diet，NCD）适应性饲养3 d。按照文献［10-12］方法，通过高脂高糖饮食（high fat-high sugar diet，HFSD）持续喂养方案联合腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）法构建T2DM大鼠。方法描述：先将大鼠先分为NCD 饲养（n=14）组和高脂-高糖饲料（high fat-high sugar diet，HFSD组；HFSD 由66.5%NCD、10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇和1%胆酸钠组成）饲养组（n=31），饲养5 周后，HFSD 组大鼠给予腹腔注射50 mg/kg STZ（0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液配置，pH 4.3），NCD 组大鼠给予等体积柠檬酸缓冲液注射；注射后3 d，将空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平＞200 mg/dL 的HFSD组大鼠进一步随机分为模型（model）组及model+低、中和高剂量CAL 组，每组7 只大鼠，用HFSD 饲养16周；其中model+低、中和高剂量CAL组大鼠通过灌胃方式分别给药10、20 和 40 mg/kg CAL（CAL 剂量参考文献［13-14］），每天 1 次，持续 16 周；NCD 组大鼠分为正常对照（normal control，NC）组（n=7）和NC+高剂量（40 mg/kg）CAL组（n=7），用NCD饲料饲养16周。

2.2 血清生化测定 给药方案结束后，对大鼠禁食过夜，通过眼眶后静脉丛穿刺采血以收集血液。4 ℃下1 207×g离心15 min 收集血清。用全自动生化仪检测血清中 TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT 和 AST 水平。用ELISA 法检测血清中FBG 和胰岛素水平，然后计算IR 稳态指数（homeostasis assessment of insulin resistance index，HOMA-IR），计算公式HOMA-IR=FBG（mmol/L）×胰岛素（mU/L）÷22.5。

2.3 组织学分析 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠后，分离出肝脏。将肝组织用标准程序的梯度乙醇和二甲苯中处理后，用石蜡包埋。将石蜡包埋的肝组织切为6 μm 厚的连续切片。切片脱蜡水化后，按试剂盒说明书，分别进行HE 和油红O 染色。并根据HE 染色情况计算肝脂肪变性程度和NAFLD 活动评分（NAFLD activity score，NAS），根据油红O 染色情况计算肝脂沉积程度。

2.4 肝组织中IL-6、IL-1β和TNF-α水平测定 取新鲜的肝组织，在4 ℃下用RIPA 匀浆后，首先，取匀浆液用BCA试剂盒检测蛋白浓度；其次，取匀浆液，根据试剂盒说明书，用ELISA 法检测匀浆液中IL-6、IL-1β和TNF-α 含量，然后根据测定的肝组织中蛋白浓度，将其换算成肝组织中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

2.5 Western blot 分析 取新鲜的肝组织，分别用RIPA 和细胞核/质蛋白分离试剂盒对组织进行匀浆，并分离总蛋白、细胞核蛋白和细胞质蛋白。用BCA蛋白质测定试剂盒测定组织匀浆的蛋白质浓度后，将每样本含等量（50 mg）蛋白的组织匀浆液进行SDS-PAGE，并将电泳后的蛋白转移到PVDF 膜上。用含5%脱脂奶粉的PBS-T 溶液封闭膜2 h 后，将膜与 I 抗 NF-κB p65（1∶4 000 稀释）、IRS-1（1∶2 000 稀释）、p-IRS-1（Ser307）（1∶1 000 稀释）、AKT（1∶2 500稀释）、p-AKT（Ser473）（1∶800 稀释）、β-actin（1∶5 000稀释）和Lamin B1（1∶3 000稀释）抗体在室温下孵育2 h；洗涤后，将膜与HRP偶联的山羊抗兔IgG（1∶2 000 稀释）在室温下孵育1 h，用ECL 试剂曝光显像，并使用Quantity One软件分析条带光密度。

3 统计学处理

计量资料用均数±标准差（mean±SD）表示，数据均采用SPSS 17.0 软件进行分析。多组之间比较选择单因素方差分析，组间均数两两比较选用LSD 法事后多重比较。P＜0.05为具有统计学差异。

结 果

1 CAL对T2DM大鼠糖脂代谢参数的影响

表1 结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠FBG 水平、胰岛素水平、HOMA-IR 值、TG 水平、TC 水平和LDL-C 水平均显著增加（P＜0.01），HDL-C 水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，模型+低、中和高剂量CAL组中上述糖脂代谢参数均发生明显改善（P＜0.05，P＜0.01），其中高剂量 CAL 的效果尤为显著（P＜0.01）。

表1 各组大鼠糖脂代谢参数的比较Table 1. Comparison of metabolic parameters in each group（Mean±SD. n=7）

2 CAL对T2DM大鼠肝脏的组织学的影响

肉眼观察结果（图1A）显示，正常对照组和正常对照+高剂量CAL组肝脏光滑鲜亮；模型组肝脏粗糙发黄有油腻感；模型+低、中和高剂量CAL 组肝脏外观随着CAL 剂量增加，逐渐光滑鲜亮。HE 染色观察结果（图1B）显示，正常对照组和正常对照+高剂量CAL 组肝组织中肝细胞正常；模型组肝组织的肝细胞呈现大量大泡性脂肪变性和气球样变；模型+低、中和高剂量CAL组的肝组织的肝细胞随着CAL剂量增加，脂肪变性和气球样变逐渐改善，其中高剂量CAL 组仅存在少量小泡性脂肪变性和气球样变。油红O 染色观察结果（图1C）显示，正常对照组和正常对照+高剂量CAL组肝组织中仅存在微量红染；模型组肝组织呈现大面积红染，且红色脂滴汇合成大泡性脂滴；模型+低、中和高剂量CAL 组的肝组织随着CAL剂量增加，红染程度逐渐降低。统计结果（表2）显示，与正常对照组比较，模型组NAS积分以及肝脂肪变性和肝脂沉积程度均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，模型+低、中和高剂量CAL 组肝组织中上述病理形态参数均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），其中高剂量CAL的效果尤为显著（P＜0.01）。

表2 各组肝组织病理形态参数的比较Table 2. Comparison of hepatic histopathological parameters in each group（Mean±SD. n=7）

Figure 1. Visual morphology and histological images of livers in each group. A：representative visual morphology of livers；B：representative HE staining images of liver tissues；C：representative Oil red O staining images of liver tissues. The scale bar=100 μm.图1 各组肝脏的肉眼外观以及肝组织学图像

3 CAL对T2DM大鼠肝损伤的影响

结果（表2）显示，与正常对照组比较，模型组血清 ALT 和 AST 以及肝组织中 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，模型+低、中和高剂量CAL组肝组织中上述肝损伤参数均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），其中高剂量CAL 的效果尤为显著（P＜0.01）。

4 CAL 对 T2DM 大鼠肝组织中 p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）表达及NF-κB p65核转位的影响

表3 各组肝损伤参数比较Table 3. Comparison of liver injury parameters in each group（Mean±SD. n=7）

结果（图2、表4）显示，与正常对照组比较，模型组肝组织中p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）及细胞核NF-κB p65 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01），细胞质NF-κB p65 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，模型+低、中和高剂量CAL 组肝组织中p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）及细胞核NF-κB p65 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），细胞质NF-κB p65 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01），其中高剂量 CAL 的效果尤为显著（P＜0.01）。

Figure 2. Expression of p-IRS-1（Ser307）and p-Akt（Ser473）and nuclear translocation of NF-κB p65 in liver tissues were detected by Western blot. A：representative bands of p-IRS-1（Ser307）expression；B：representative bands of p-Akt（Ser473）expression；C：representative bands of nuclear NF-κB p65 and cytopasmic NF-κB p65 expressions.图2 Western blot检测肝组织中p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）表达及NF-κB p65核转位

表4 各组肝组织中p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）及细胞核NF-κB p65和细胞质NF-κB p65蛋白相对表达水平的比较Table 4. Comparison of the relative expression levels of p-IRS-1（Ser307），p-Akt（Ser473），nuclear NF-κB p65 and cytopasmic NF-κB p65 proteins in liver tissues in each group（Mean±SD. n=7）

讨 论

糖脂代谢稳态失衡不仅是NAFLD 的伴发现象，也是驱动肝脂肪变性重要的因素。已有报道表明，IR、TC、TG 和 LDL-C 水平持续异常升高和 HDL-C 水平持续异常降低能加重T2DM 模型小鼠的肝脂肪变性［15］。此外，肝脂肪变性能增加肝细胞对促炎介质的敏感性，且持续的慢性炎性反应能加剧肝损伤［16-17］。 本 研 究 结 果 显 示 ，CAL 对 HFSD 喂 养 的T2DM 模型大鼠具有抑制IR、维持糖脂代谢稳态、改善肝脂肪变性并减轻肝损伤的药理作用，这些数据表明CAL 能减轻T2DM 模型大鼠肝脏的NAFLD 病变，提示CAL 可能是潜在是用于预防T2DM 发生NAFLD病变的药物。

为探讨CAL 抑制T2DM 模型大鼠肝损伤的机制，本研究进一步分析了影响炎性反应中的经典信号 NF-κB 的活性。有报道［18］称，HFSD 可激活肝组织中 NF-κB 信号，并通过 NF-κB 信号介导的炎性反应而加快NAFLD 的进展。抑制NF-κB 信号活性可减少促炎介质的生成和减轻肝损伤，从而达到减缓NAFLD 的进展的作用［19］。本研究结果表明，CAL 能降低HFSD 喂养的T2DM 模型大鼠肝组织中NF-κB p65核转位，说明CAL能减弱肝组织中NF-κB信号活性，提示CAL 可能通过负调控NF-κB 信号活性来控制肝脏炎性反应和肝损伤。

此外，IR 是 T2DM 和 NAFLD 共同的起始因素之一，其与胰岛素信号转导障碍有关［20］。胰岛素在调节糖脂稳态中起着重要作用。IRS-1 是胰岛素受体的主要效应器，负责胰岛素信号转导。当胰岛素与胰岛素受体结合时，IRS-1 的Ser307 位点磷酸化能阻断胰岛素信号转导，导致IR；而降低IRS-1 的Ser307位点磷酸化水平能恢复胰岛素信号转导，进而抑制IR［21］。PI3K/Akt 信号是响应胰岛素信号的 IRS-1 最重要的下游信号之一［21-25］。当 IRS-1 的 Ser307 位点磷酸化后，活化的IRS-1 能激活PI3K，PI3K 活化能使细胞质膜产生第二信使PIP3，PIP3 与磷脂酰肌醇依赖激酶 2（PDK2）结合磷酸化 Akt 的 Ser473（也称Akt1），激活 Akt［22］。Akt 活化能通过葡萄糖转运体（GLUTs）转座和GSK3β 等多种途径调控糖脂代谢［23-24］。且研究［22-23，25］表明，抑制 Akt 的 Ser473 位点磷酸化后，T2DM 模型大鼠表现为胰岛素敏感性增加和肝损伤降低。本研究显示，CAL能抑制HFSD喂养的T2DM 模型大鼠肝组织中IRS-1 的Ser307 位点磷酸化和Akt 的Ser473 位点磷酸化，提示CAL 可以通过恢复T2DM 大鼠胰岛素信号转导来降低IR 和维持糖脂代谢稳态。

综上所述，CAL 能抑制 HFSD 喂养的 T2DM 模型大鼠的IR、改善肝脂肪变性和肝脂蓄积并减轻肝损伤，且这些作用可能与其恢复胰岛素信号转导和减弱NF-κB信号活性有关。