控制血糖通过下调KLF6而抑制STZ所致的1型糖尿病大鼠肾小管上皮细胞损伤*

张会芳， 向珈谊， 梁露群， 王 丹， 周星丞， 张小欢， 毛彦稳， 王圆圆， 郭 兵

（贵州医科大学基础医学院病理生理教研室，贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室，贵州贵阳550025）

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）慢性微血管并发症之一，是一种高血糖诱导肾脏微血管病变并逐渐影响肾脏功能的严重并发症［1］。在DKD 的发生过程中，糖脂代谢紊乱导致炎症因子释放［2］；肾小管上皮细胞的凋亡，促进了肾间质纤维化的发展［3］；肾小管上皮细胞向间充质细胞转化和细胞外基质大量沉积引起的纤维化病变造成肾脏功能进一步损伤［4］，表明炎症反应和凋亡在DKD的发展中扮演着关键角色。

核转录因子 Krüppel 样因子 6（Krüppel-like factor 6，KLF6）是 Sp1/Krüppel 样转录因子家族中的一个亚家族成员［5］，参与了包括肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）等多种肝脏疾病［6］。已有文献报道，KLF6 通过调节过氧化物酶体增殖物活化受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）参与了 NASH 的调节过程。在巨噬细胞，KLF6 可以负调控PPARγ 的表达，促进炎症因子的释放［7］。而 KLF6 在 DKD 发生发展中的作用机制尚未完全阐明。胰岛素（insulin，INS）是胰岛β 细胞分泌的一种肽类激素，具有较好的控制血糖水平的作用，是临床治疗DM 的常用药物［8］。本研究拟予以INS 控制DM 大鼠血糖，观察肾组织KLF6 的表达变化；将大鼠近端肾小管上皮NRK-52E细胞予以正常糖（normal glucose，NG）或高糖（high glucose，HG）刺激，或在HG 培养后置于NG 中培养，或分别过表达及敲减KLF6表达，观察KLF6 表达变化和大鼠肾小管上皮细胞纤维化病变情况，探索KLF6 在DKD 发生发展的作用和机制，为DKD 的临床治疗提供一定的实验依据。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 清洁级6 周龄雄性SD 大鼠，体重（200±20）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号为SCXK（京）2009-0007，质量合格证号为0257330。

1.2 细胞 大鼠近端肾小管上皮细胞系NRK-52E购自中国科学院细胞库。

1.3 试剂 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗小鼠IgG、HRP 标记的山羊抗兔IgG、免疫组织化学检测试剂及显色试剂盒均购自Vector；BCA蛋白定量试剂盒及ECL显色剂购自北京碧云天生物研究所；抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、III 型胶原蛋白（collagen type III，Col III）、钙黏蛋白（E-cadherin）和KLF6抗体均购自Proteintech；抗肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗体（Santa Cruz）；抗白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）抗体（北京博奥森）；抗PPARγ抗体（Cell Signaling Technology）；抗纤维连接蛋白（fibronectin，FN）抗体（Abcam）；抗β-actin 抗体（武汉普美克技术有限公司）；抗GAPDH 抗体（武汉普美克技术有限公司）；超敏ECL 化学发光试剂盒（碧云天）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ；Sigma）；INS（诺和诺德）；蛋白marker（赛默飞）；实时定量PCR 引物购自广州锐博公司；实时定量GAPDH 引物购自上海生物工程公司；细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物公司）；KLF6过表达质粒（pCAG-GFP-Puro01-KLF6，OEKLF6）和KLF6小干扰 RNA（KLF6siRNA，si-KLF6）均购自上海毅乐生物科技有限公司。

2 方法

2.1 DM 模型的建立及分组 将SD 大鼠随机分为正常对照（normal control，NC）组、DM 组和INS 治疗组（INS组），每组6只。DM组及INS组大鼠采用腹腔注射55 mg/kg 链脲佐菌素的方法复制DM 模型，72 h后测量空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L 为造模成功。成模 4 周起 NC 组及 DKD 组予 0.1 mL 溶媒，INS 组于造模成功4周后给予INS治疗，剂量为22 U。剂量实行个体化，随机血糖控制在7～8 mmol/L 以下，治疗6周。DKD 造模方法如下，将 STZ 溶于 0.1 mol/L 无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5），一次性尾静脉注射 2% STZ（55 mg/kg）复制 DM 大鼠模型，72 h 测大鼠空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L 且尿糖阳性判断为造模成功，成模1 周后行尿蛋白定性检测，尿蛋白阳性为DKD模型复制成功。

2.2 细胞分组和转染 正常大鼠肾小管上皮NRK-52E细胞在37 ℃、5%CO2培养箱中，在含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco）和5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培养液（Gibco）中进行维持培养。含2% FBS 的NG（5.5 mmol/L 葡萄糖）培养液培养细胞48 h，为 NG 组；含 2% FBS 的HG（55 mmol/L 葡萄糖）培养液培养细胞 48 h，为 HG 组；含 2% FBS 的 HG 培养液培养细胞24 h 后，转入含2% FBS 的NG 培养液继续培养细胞24 h，为HG转入NG组（HG to NG组）。

待细胞融合度为40%～50%时，用Lipofectamine 2000（Invitrogen）瞬时转染 NRK-52E 细胞，随机将细胞分为NG+空载体（vector）组、NG+OE-KLF6 组、HG组和HG+si-KLF6组，培养48 h。

2.3 标本采集及生化指标的检测 注射6 周INS后，将所有大鼠处死。大鼠处死前禁食6～8 h，乙醚麻醉，股动脉取血，分离血清，置于-80 ℃冰箱保存，用于相应血生化指标的检测。剖腹，用4 mL 生理盐水于左心耳注入以灌洗脏器，取出双侧肾脏，部分用40 g/L 多聚甲醛固定，其余肾脏组织放入分装管，置于-80 ℃冰箱保存备用。取尾部末梢全血用DCA Vantage Analyzer 检测糖化血红蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）；用 ONETOUCH SureStep（Hospital）稳步型血糖仪检测血糖；用雅培2000 全自动生化仪检测甘油三酯、血尿素氮和尿蛋白。

2.4 肾脏组织病理学检查 4%甲醛固定肾脏组织，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后制成3 μm 石蜡切片，HE 和天狼星红染色后，在光镜下观察肾脏组织形态学变化并拍照保存。HE 染色观察肾组织的形态结构的变化，天狼星红染色观察肾组织的纤维化病变程度。

2.5 免疫组织化学染色 将石蜡切片在60 ℃烤片1 h后脱蜡至水，洗涤后，30%H2O2与甲醇按1∶9的比例混合，滴于组织切片上，室温10 min 灭活过氧化物酶。高压抗原修复，驴血清封闭1 h，加入兔抗KLF6（1∶100）4 ℃孵育过夜。第2 天由冰箱取出后，洗涤3次，加入山羊抗兔IgG（1∶200），室温孵育1 h。洗涤后，3-氨基-9-乙基咔唑（3-amino-9-ethylcarbazole，AEC）染色，自来水终止反应，苏木精溶液染核，封片，显微镜观察。结果计数：采用ImageJ分析软件在高倍（×200）镜下每张切片随机取10个视野确定阳性染色的区域，计算阳性染色的面积占总面积的比例（%）。

2.6 Western blot 检测肾组织及NRK-52E 细胞的蛋白表达水平 从-80 ℃冰箱里取出肾脏组织，用滤纸吸干水分，称取50～100 mg，加入组织蛋白裂解液后置于匀浆器上研磨后，12 000 r/min离心15 min，吸取上清液，用BCA试剂盒测定各组蛋白浓度，按所得浓度计算出需要加入的loading buffer 体积，加入loading buffer后充分混匀，在预先准备的沸水中煮15 min，上样。6孔板培养的细胞倒掉培养基，PBS清洗，加入细胞裂解液，刮取细胞蛋白于EP 管中，沸水煮10 min，上样。蛋白经过SDS-PAGE 分离后，转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST 洗膜，加入抗KLF6（1∶1 000）、PPARγ（1∶1 000）、α-SMA（1∶800）、Col III（1∶1 000）、IL-6（1∶1500）、TNF-α（1∶500）、Bax（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）和FN（1∶1 000）抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入相应Ⅱ抗（1∶10 000）室温孵育1 h，TBST洗膜后，加入ECL荧光显色液，置于凝胶成像仪曝光，ImageJ软件分析结果。

2.7 RT-qPCR 检测 PPARγ 的 mRNA 表达 Trizol法提取各组大鼠肾组织总RNA，且测定提取的总RNA浓度；按翊圣生物公司试剂盒说明书，以20 μL 反转录体系合成cDNA，以cDNA 为模板进行PPARγ 的扩增。PPARγ 引物由广州锐博有限公司合成，正向引物序列为5′-GGAATCAGCTCTGTGGACCTCTC-3′，反向引物序列为 5′-TGGAGAAATCAACCGTGGTAAAG-3′；GAPDH 引物由生工合成，正向引物序列为5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′，反向引物序列为 5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′。 以 GAPDH为内参照，采用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR分析系统进行qPCR实验，结果以2-ΔΔCt法进行计算。

2.8 流式细胞技术检测细胞凋亡 使用annexin VFITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒。待细胞密度为80%时，胰酶消化细胞至于离心管中，用预冷的PBS 洗3次，并加入适量PBS 重悬细胞，将重悬好的细胞随机分组：对照组、PE 单染组、FITC 单染组和实验组（双染），向相应组别中加入 10 μL 的 PE 或者 FITC 标记的抗体，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，使用流式细胞术检测，按照顺序：对照组、PE 单染组、FITC 单染组和实验组（双染）依次设门，进行阳性细胞计数，结果以百分数表示。

3 统计学处理

数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示。两组间比较的数据用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠一般情况与相关生化指标检测结果

NC 组大鼠生长状况良好，活动正常，精神状态良好；DM 组大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食等现象。与NC 组相比，DM 组大鼠肾重/体重、血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、血尿素氮和尿蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与DM 组相比，经过INS 治疗后的大鼠肾重/体重、血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、血尿素氮和尿蛋白水平均显著下降（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠肾重/体重、血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、尿素氮和尿蛋白水平的比较Table 1. The levels of kidney/body weight，blood glucose（BG），glycated hemoglobin（HbA1c），triglyceride（TG），blood urea nitrogen（BUN）and urine protein（UP）in rats（Mean±SD. n=6）

2 大鼠肾脏组织的病理学改变

HE 染色结果显示，NC 组肾小球固有细胞未见明显增生，系膜区未见明显增宽，基底膜未见明显增厚，肾小管未见明显萎缩，上皮细胞可见少许颗粒变性，肾间质未见纤维化及炎症细胞浸润，血管壁未见明显增厚；DM 组系膜及间质轻度节段增生，上皮细胞颗粒及灶状空泡变性，基底膜未见明显增厚，肾小管灶性萎缩（萎缩面积＜10%），肾间质可见灶性淋巴细胞及单个核细胞浸润，伴纤维化增生，小血管壁未见明显增厚；与DM 组相比，INS 组上述病变均有所减轻。天狼星红染色结果显示，与NC组相比，DM 组伴有肾小管-间质纤维化，阳性染色明显增加；INS 组与DM组相比，阳性染色明显减少。见图1。

3 KLF6在各组肾组织中的表达和分布

免疫组化染色结果显示，与NC组相比，DM 组肾小管胞浆及胞质颗粒状KLF6 蛋白阳性表达增加；INS处理后，KLF6在肾小管的阳性表达比例减少（P＜0.05），见图 2A。Western blot 结果显示，与 NC 组相比，DM 组 KLF6 蛋白表达明显增加；经过 INS 治疗后，KLF6蛋白表达减少，见图2B。

4 各组大鼠肾组织中PPARγ、α-SMA、Col III、IL-6、TNF-α和Bax表达的变化

Figure 1. Histological changes of rat kidney tissues in each group（×200）.图1 各组大鼠肾组织形态学变化

Figure 2. The expression and distribution of KLF6 in rat renal tissues detected by immunohistochemical staining（A，×200）and Western blot（B）. KLF6 was expressed in the cytoplasm and nucleus of renal tubular epithelial cells in the renal cortex（black arrow）. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs DM group.图2 免疫组化染色和Western blot检测KLF6在各组大鼠肾组织中的表达与分布

与 NC 组相比较，DM 组 α-SMA、Col III、IL-6、TNF-α 和 Bax 的蛋白水平显著升高，而 PPARγ 蛋白和mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）；与DM 组相比，INS 组IL-6、TNF-α、α-SMA、Col III 和Bax 的蛋白水平显著降低，而PPARγ 蛋白和mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05），见图3。

5 NG 条件下过表达KLF6 可促进肾小管上皮细胞损伤和纤维化

为了进一步研究KLF6 与细胞表型的关系，在NG 环境中予 NRK-52E 细胞 Lipofectamine 2000 瞬时转染KLF6 过表达质粒，培养48 h，可见KLF6 表达水平明显升高（图4A）。与NG+vector 组相比，NG+OEKLF6组NRK-52E 细胞中上皮细胞标志物E-cadherin表达水平显著降低，纤维化指标FN 及炎症指标IL-6表达水平均显著升高（图4B～E），细胞凋亡率亦显著升高（图4F）。

Figure 3. Expression of PPARγ，Col III，α-SMA，TNF-α，IL-6，and Bax in rat kidney tissues of each group. A：the protein levels of PPARγ，Col III，α-SMA，TNF-α，IL-6 and Bax determined by Western blot；B：the expression of PPARγ mRNA determined by RT-qPCR. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs DM group.图3 各组大鼠肾组织中PPARγ、Col III、α-SMA、TNF-α、IL-6和Bax的表达

Figure 4. Effects of KLF6 overexpression on the protein levels of E-cadherin，FN and IL-6，and apoptosis of NRK-52E cells in NG environment. A：NRK-52E cells were transfected with empty vector（NG+vector）and KLF6-overexpressing plasmid（NG+OE-KLF6）using Lipofectamine 2000 on 6-well culture dishes；B to E：Western blot for determining the protein levels of E-cadherin，FN and IL-6；F：flow cytometry for analyzing the apoptosis of NRK-52E cells. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NG+vector group.图4 NG环境中过表达KLF6对NRK-52E细胞E-cadherin、FN和IL-6蛋白水平和凋亡的影响

6 HG 条件下敲减KLF6 表达可减轻肾小管上皮细胞损伤和纤维化

将NRK-52E 细胞以Lipofectamine 2000 瞬时转染si-KLF6后置于HG 环境中，培养48 h，可见KLF 表达水平明显降低（图5A）。与HG 组相比，HG+si-KLF6组NRK-52E 细胞中上皮细胞标志物E-cadherin表达水平显著降低，纤维化指标FN 及炎症指标IL-6表达水平均显著降低（图5B～E），细胞凋亡率亦显著降低（图5F）。

7 PPARγ可能是KLF6的下游靶基因

与对照组相比，过表达KLF6后PPARγ蛋白表达水平降低，而敲减KLF6后PPARγ蛋白表达水平升高（图6）。通过生物信息学网站JASPER，预测KLF6与PPARγ启动子可能存在的结合位点（表2），进一步提示PPARγ可能是KLF6的下游靶基因。

表2 用生物信息学网站JASPER预测KLF6与PPARγ的调控位点区域Table 2. Predicting the regulatory sites of KLF6 and PPARγ by the bioinformatics website JASPER

8 控制血糖对NRK-52E 细胞中KLF6、PPARγ、E-cadherin、FN和IL-6蛋白水平的影响

为了进一步研究HG 对于NRK-52E 细胞中KLF6、PPARγ、E-cadherin、FN 和 IL-6 蛋白水平的影响，我们将NRK-52E 细胞于HG 培养基刺激24 h 后再置于NG 培养基培养24 h。与NG 组相比，HG 组KLF6、纤维化指标FN 及炎症指标IL-6 表达增多，PPARγ 和上皮细胞标志物 E-cadherin 减少；与 HG 组相比，HG to NG 组 KLF6、FN 和 IL-6 表达减少， PPARγ和E-cadherin表达增加（P＜0.05），见图7。

Figure 6. Effects of KLF6 overexpression（A）or knockdown（B）on the protein level of PPARγ in NRK-52E cells. The protein levels of KLF6 and PPARγ were determined by Western blot. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NG+vector group；#P＜0.05 vs HG group.图6 过表达或敲减KLF6对NRK-52E细胞中PPARγ表达的影响

Figure 7. Effects of blood glucose control on the protein levels of KLF6，PPARγ，E-cadherin，FN and IL-6 in NRK-52E cells. The protein levels of KLF6，PPARγ，E-cadherin，FN and IL-6 were determined by Western blot. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NG group；#P＜0.05 vs HG group.图7 控制血糖对NRK-52E细胞中KLF6、PPARγ、E-cadherin、FN和IL-6蛋白水平的影响

讨 论

据国际糖尿病联合会（International Diabetes Federation，IDF）的最新统计数据显示，2019 年全球约 4.63 亿 20～79 岁成人患 DM，预计到 2045 年，DM患者会达到7.002亿［9］，约30%～35%的DM 患者可发展为 DKD［10］。随着 DM 发病率逐年上升，DKD 已经严重影响了人们的身体健康。

DKD 发病机制十分复杂，其中炎症、凋亡和纤维化在DKD 发病机制中起着重要作用。有研究发现，在肾脏疾病的发生过程中，炎症细胞的浸润及细胞外基质增生导致了肾脏的炎症和间质纤维化［11］。肾小管上皮细胞的凋亡是间质纤维化发展的早期事件，参与了 DKD 的进展［12］。在本研究中，DM 组大鼠肾组织病理结果显示，系膜及间质轻度节段增生，上皮细胞颗粒及灶状空泡变性，肾间质可见灶性炎症细胞浸润，且Western blot 结果显示胶原沉积明显增加，炎症因子TNF-α 和IL-6 蛋白表达明显增多，凋亡相关蛋白Bax 表达增多，提示DM 大鼠发生了炎症、凋亡及肾小管-间质纤维化病变。而经过INS 处理后，DM 大鼠肾组织炎症因子、凋亡相关蛋白Bax 表达及病理变化都有所降低与改善。

KLF6 是巨噬细胞中激活促炎基因表达的转录因子之一［13］，在人近端肾小管上皮细胞中过表达KLF6 会加剧细胞炎症及凋亡反应［14］。在分子水平上，KLF6 可通过抑制巨噬细胞中的PPARγ和miR-223等抗炎基因的表达，提高促炎基因的表达［15］。以上结果提示，KLF6 表达增加会促进炎症及凋亡反应。本实验研究结果显示，DM 组肾组织α-SMA、Col III 和Bax 蛋白表达水平明显升高，并伴有炎症因子上调。予INS 治疗后，INS 组肾脏组织α-SMA、Col III和Bax 蛋白及炎症因子较DM 组降低。为了明确KLF6 在肾小管上皮细胞损伤中的作用，肾小管上皮细胞分别转染过表达KLF6质粒后予以NG 环境中培养，转染si-KLF6后置于HG环境中培养。结果显示，与 NG+vector 组相比，NG+OE-KLF6 组 E-cadherin 的表达降低，FN 及IL-6 的表达升高，细胞凋亡率有所增加；与 HG 组相比，HG+si-KLF6 组的 E-cadherin 表达升高，FN、IL-6的表达降低，细胞凋亡率有所降低，提示KLF6 参与了肾小管-间质纤维化炎症病变及细胞凋亡过程。为进一步明确HG 是否通过上调肾小管上皮细胞KLF6介导细胞损伤，分别予以NRK-52E细胞NG，HG，以及HG培养24 h后NG培养，与NG组相比，HG 组 KLF6、FN 和 IL-6 表达增多，PPARγ 和 E-cadherin减少；与HG组相比，HG to NG 组KLF6、纤维化指标FN 及炎症指标IL-6表达降低，PPARγ和上皮细胞标志物E-cadherin增多，提示HG通过上调KLF6的表达介导肾小管上皮细胞损伤。

PPARγ 是一个核激素受体超家族的成员，控制着许多生理过程，如葡萄糖和脂质代谢、INS 敏感性和炎症反应［16-17］。PPARγ 的合成激动剂，包括噻唑烷二酮（thiazolidinediones，TZDs）、罗格列酮和吡格列酮等，已经广泛用于临床治疗高血糖及INS 抵抗［18］。TZDs 在许多器官如肺、肠、肾脏等器官也用于抗纤维化治疗［19-20］。在DKD 的发展过程中，PPARγ可以通过抑制炎症信号通路从而改善肾脏的炎症和纤维化病变［21］。本实验研究结果中，DM 组大鼠肾组织PPARγ的蛋白和mRNA表达水平均显著降低，而经过INS 治疗控制血糖后PPARγ 蛋白与mRNA 表达水平有所恢复，提示PPARγ 表达下调参与了DKD的发展过程。

已有研究表明，在人肾小管上皮细胞中过表达KLF6时，PPARγ 的表达减少；敲减KLF6时，PPARγ的表达有所增加［21］。且在巨噬细胞中，KLF6 可通过调节NF-κB和抑制PPARγ的表达来促进巨噬细胞炎症基因的表达［23］。提示 KLF6 可以抑制 PPARγ 表达，发挥促炎效应。本研究在NRK-52E 细胞中分别过表达及敲减KLF6，观察PPARγ 的变化。与NG+vector 组相比，NG+OE-KLF6 组 PPARγ 表达降低；与HG 组相比，HG+si-KLF6 组 PPARγ 表达升高，提示KLF6 与PPARγ 存在着某种负调控关系。并且通过生物信息学网站 JASPER 对 KLF6 与PPARγ基因启动子进行分析，发现两者间存在多个位点的结合位。因此，结合以上实验与软件预测结果，推测KLF6 可下调PPARγ的表达。

综合文献和本实验研究结果，我们认为HG可使KLF6蛋白表达增多，抑制PPARγ的mRNA 和蛋白表达，其机制可能是KLF6 通过抑制PPARγ 而影响炎症因子表达和凋亡反应，加剧了纤维化进程，从而参与了糖尿病肾病的发生发展；而控制血糖可通过下调KLF6 而抑制1 型DM 大鼠的肾小管上皮细胞损伤。因此进一步研究KLF6 在肾间质纤维化中的调节作用，对DKD的治疗具有重要意义。