miR-22通过靶向抑制DDIT4促进糖尿病肾病肾小管上皮细胞DNA损伤*

梁 丹， 赵思琪， 李志阳， 肖雅文， 丁 菁， 肖 瑛△， 郭 兵

（1贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室，贵州医科大学病理生理学教研室，贵州贵阳550025；2秦皇岛军工医院，河北秦皇岛066000）

研究发现，糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）患者由于持续的高血糖，肾小球系膜细胞中线粒体会产生氧化性DNA 损伤，毛细血管扩张性共济失调突变蛋白（ataxia telangiectasia mutated，ATM）-细胞周期检查点激酶2（checkpoint kinase 2，Chk2）信号通路是DNA 损伤中主要的修复通路之一［1］。ATM基因是参与DNA 损伤反应的重要基因，可以检测到DNA 双链断裂（double-strand breaks，DSBs），调节DNA损伤修复；Chk2基因是编码丝氨酸/苏氨酸激酶的一种肿瘤抑制基因，处于ATM基因的下游。DNA 的 DSBs 会导致 ATM 和 Chk2 持续磷酸化，激活ATM-Chk2通路来进行DNA 损伤修复［2］。研究发现，诸多因子参与了DNA 损伤修复过程，其中DNA 损伤诱导转录物 4（DNA damage-inducible transcript 4，DDIT4）已被证明能被DNA 损伤诱导，且DDIT4 对DNA 损伤有负调控作用［3］。在高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞及链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病（diabetes mellitus，DM）大鼠模型中，DDIT4的表达均下调［4］，提示 DKD 时的 DNA 损伤可能与DDIT4的减少有关，但具体机制仍不清楚。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一类非编码RNA，在DNA 损伤反应中起着重要的作用。最近的研究已经确定了几种miRNA 在DKD 肾脏纤维化中发挥着重要作用，参与了DKD 的病理过程［5-7］。有研究发现miR-22 与异常生理条件下DNA 损伤信号传导途径有着密不可分的联系，miR-22 能够抑制DNA 损伤修复［8］。另有研究报道，miR-22 在 DKD 大鼠的肾脏组织中表达上调，并通过靶向PTEN发挥抑制自噬作用，从而促进肾小管-间质纤维化［9］。上述研究表明，miR-22 可能成为DKD 中有吸引力的治疗靶标，且其作用机制可能与DNA 损伤修复密切相关。因此本研究旨在探讨DKD 时miR-22 能否靶向抑制DDIT4的表达，从而通过ATM-Chk2信号通路促进DNA 损伤，以期进一步阐明DKD 的发病机理，为预防DKD的进展提供新的理论依据。

材料和方法

1 动物和细胞

健康清洁级雄性C57BL 小鼠，体重（20±5）g，许可证号为SCXK（京）2016-0002，购自北京斯贝福生物技术有限公司。大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52E购自ATCC。

2 主要试剂

正常糖（normal glucose，NG；5.5 mmol/L 葡萄糖）培养基和0.25%胰蛋白酶购自HyClone；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Biological Industries；DDIT4过表达质粒购自上海毅乐生物科技有限公司；miR-22 mimics 和inhibitor 购自广州瑞博生物科技有限公司；聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）购自Polyscience；兔抗Chk2 多克隆抗体购自Abcam；兔抗DDIT4、ATM、p-ATM 和 p-Chk2 多克隆抗体均购自上海爱必信生物科技有限公司；抗β-actin 单克隆抗体购自武汉普美克生物技术有限公司；ECL化学发光试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒和RIPA 裂解液等均购自碧云天公司；STZ 购自Sigma。电泳仪和转膜仪购自北京六一公司；凝胶成像系统购自Bio-Rad；高速低温离心机购自Eppendorf。

3 主要方法

3.1 动物造模及分组 将20 只C57BL 小鼠饲以标准饲料、自由饮水、适宜温度和湿度及每天12 h 照明，适应性喂养1 周后随机等分为正常对照（normal control，NC）组和DM 组。造模前1 d 称重，禁食4 h，造模方式为：DM 组小鼠连续5 d 腹腔注射STZ 溶液（50 mg·kg-1·d-1，溶媒为0.01 mol/L、pH 4.5的灭菌柠檬酸-枸橼酸钠缓冲溶液）；NC组小鼠连续5 d腹腔注射等量溶媒。1周后尾静脉采血测空腹血糖，血糖值大于或等于16.7 mmol/L则视为造模成功。

3.2 NRK-52E 细胞的培养 将细胞接种于培养瓶内，放入恒温培养箱等待细胞贴壁，设定5% CO2，37 ℃恒温的培养条件，当细胞融合度达到80%左右时可进行传代并用于后续实验。将细胞分为高糖（high glucose，HG；30 mmol/L葡萄糖）组和NG组。

3.3 动物的处死和体液采集 成模16 周后处死各组小鼠，处死前1 d 用代谢笼收集24 h 尿液，记录尿量，收集的尿液离心后取部分上清送检；处死前禁食4 h，麻醉，称重，眼眶取血，4 000 r/min 离心10 min 分离血清，将血清置于-20 ℃冷冻保存；取血后剪开腹腔暴露双侧肾脏，在冰上轻柔去除肾脏外包膜，称取双侧肾脏重量后取一部分肾脏用4%中性甲醛固定，其余部分置于-80 ℃超低温冰箱冷冻保存。

3.4 动物生化指标的检测 用葡萄糖氧化酶法检测血糖（blood glucose，BG），脲酶连续监测法检测血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN），氧化酶法检测血清肌酐（serum creatinine，SCr），免疫比浊法检测尿微量白蛋白（microalbumin，MALB），氧化酶法检测尿肌酐（urine creatinine，U-Crea），邻苯三酚红钼法测尿总蛋白（urinary total protein，UTP）。以尿蛋白浓度乘以24 h尿量作为24 h UTP。

3.5 肾组织形态学观察 取部分4%中性甲醛固定的小鼠肾组织，用石蜡包埋后切片。脱蜡后进行HE染色，光镜下观察肾组织切片的形态学改变。

3.6 Western blot 检测小鼠肾皮质及NRK-52E 细胞中ATM、p-ATM、Chk2、p-Chk2 和DDIT4 蛋白水平称取 0.1 g 小鼠肾皮质，加入 500 μL 裂解液，在管内放入磁珠经组织研磨机研磨成液体，于4 ℃、12 000 r/min 离心30 min，吸取上清于新的EP 管中，即为所提取的蛋白溶液，BCA 法蛋白定量后，根据浓度加入适量的上样缓冲液，经SDS-PAGE、转膜、封闭后，分别加入Ⅰ抗（anti-DDIT4、anti-ATM 和 anti-p-ATM 均按 1∶2 000 稀释，anti-Chk2 和 anti-p-Chk2 按 1∶1 000稀释，anti-β-actin 按1∶5 000 稀释），4 ℃孵育过夜，次日回收Ⅰ抗，TBST 洗膜后，加入Ⅱ抗，室温孵育1 h，经ECL 显影液显影，成像仪曝光。所得蛋白条带用Image Lab 5.1软件分析处理。

3.7 彗星实验检测DNA的DSBs情况 提前准备好所需液体和制胶倒模，取正常熔点琼脂糖0.3 g 和50 mL PBS，微波炉中加热至沸腾，将正常熔点琼脂糖液倒入模具，待其凝固，放入烤箱内烘干12 h 以上，收取细胞悬液，取0.3 g 低熔点琼脂糖和50 mL PBS，加热至沸腾制备低熔点琼脂糖液，将细胞悬液与低熔点琼脂糖液按1∶1 混合，吹打混匀后迅速倒在第1层胶上。常温放置待其凝固，放入4 ℃冰箱冷却15 min以上，再倒入至少1 cm厚的裂解液，避光平放入 4 ℃冰箱，裂解 5～8 h，裂解后用 PBS 轻柔冲洗胶，于25 V、300 mA 电泳，完成后用中和液迅速冲洗2 次，风干5 min，再将胶转移到载玻片上，以5 mg/L的EB 染色液染色，避光风干5 min，镜下观察彗尾长度。

3.8 流式细胞术 收取细胞，用70%乙醇固定液充分重悬细胞，放入4 ℃冰箱固定24 h。800 r/min离心4 min，倒掉固定液，加入PBS 充分重悬细胞；800 r/min 离心 4 min，倒掉 PBS，加入周期试剂盒 PI 染色buffer、每管500 μL，避光常温放置15 min，选择相应检测指标和停止条件，设出对应的门，重悬细胞并放入样本夹，等待探针吸取细胞。将G1、S 和G2期细胞比例进行统计，判断细胞阻滞的周期。

4 统计学处理

Western blot 图像的数据提取使用Image Lab 软件。彗星实验图像的数据提取使用CASP 软件。实验数据均用SPSS 21.0软件进行分析处理，数据采取均数±标准差（mean±SD）形式。两组间的对比在正态性检验之后用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 DM小鼠生化指标的变化

DM 组小鼠BG、BUN、24 h MALB、24 h UTP、SCr和肾脏指数（kidney index，KI）均明显高于NC 组，见表1。

表1 NC组和DM组小鼠血糖、血尿素氮、24 h尿微量白蛋白、24 h尿总蛋白、血清肌酐和肾脏指数的变化Table 1. The changes of blood glucose（BG），blood urea nitrogen（BUN），24 h urinary microalbumin（MALB），24 h urinary total protein（UTP），serum creatinine（SCr）and kidney index（KI）in NC and DM groups（Mean±SD. n=6）

2 DM小鼠肾组织的病理变化

小鼠肾组织HE 染色后可见，NC 组小鼠肾小球形态较规则，肾小管结构清晰，间质无炎症细胞浸润；DM 组小鼠肾小管排列紊乱，且发生了萎缩，肾小管与基底膜有黏连，间质有炎症细胞浸润，见图1。

3 DM 小鼠肾皮质及HG 培养的NRK-52E 细胞中ATM、p-ATM、Chk2和p-Chk2蛋白水平的变化

Western blot 结果显示，与 NC 组相比，DM 组中的 ATM 和 Chk2 无明显变化，p-ATM 和 p-Chk2 蛋白水平增加（P＜0.05）；HG 组同NG 组比较也呈同样的变化，见图2、3。

Figure 1. The histomorphological changes of renal tissues in NC and DM groups.图1 NC组和DM组小鼠肾组织形态学变化

Figure 2. The protein levels of p-ATM and p-Chk2 in kidney tissues of NC and DM groups. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NC group.图2 NC组和DM组小鼠肾组织中p-ATM和p-Chk2蛋白水平的变化

4 HG培养的NRK-52E细胞DNA的DSBs情况

彗星实验结果显示，与NG 组相比，HG 组细胞彗尾更长（P＜0.05），DNA双链断裂程度加重，见图4。

5 HG培养后NRK-52E细胞发生了周期阻滞

与 NG 组相比，HG 培养 24 h 与 48 h 的细胞均发生了明显的细胞周期阻滞，HG 培养24 h后的细胞阻滞在G1期（P＜0.05），HG 培养48 h 后的细胞阻滞在S期（P＜0.05），见图5。

6 DM 小鼠肾皮质及HG 培养的NRK-52E 细胞中DDIT4表达水平的变化

Western blot 结果显示，与 NC 组相比，DM 组中的DDIT4 的蛋白表达降低（P＜0.05）；HG 组与NG 组比较也降低，见图6、7。

Figure 3. The protein levels of p-ATM and p-Chk2 in the NRK-52E cells of NG group and HG group. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG group.图3 NG组和HG组细胞中p-ATM和p-Chk2的蛋白表达水平

Figure 4. The length of comet tail in NG group and HG group. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG group.图4 正常糖和高糖组细胞慧尾长度的变化

7 HG 培 养 的 NRK-52E 细 胞 过 表 达 DDIT4 后ATM、p-ATM、Chk2和p-Chk2蛋白水平的变化

HG 培养的NRK-52E 细胞中过表达DDIT4 后，ATM 和Chk2表达无明显变化，p-ATM 和p-Chk2的蛋白水平明显降低（P＜0.05），见图8。

8 HG培养的NRK-52E细胞过表达DDIT4使DNA的DSBs程度减轻

将分别转染DDIT4 空载质粒和DDIT4 过表达质粒的NRK-52E 细胞分别用NG 和HG 培养基培养，48 h 后收集活细胞，通过彗星实验检测结果显示，在过表达DDIT4 后，DNA 双链断裂的程度有所改善（P＜0.05），见图9。

9 HG 培养的NRK-52E 细胞分别过表达和抑制miR-22 后 ATM、p-ATM、Chk2、p-Chk2 和 DDIT4蛋白水平的变化

HG 培养的NRK-52E 细胞中过表达miR-22 后，ATM 和Chk2表达无明显变化，p-ATM 和p-Chk2的蛋白水平增加，DDIT4 的蛋白水平降低（P＜0.05）；抑制miR-22 后，ATM 和 Chk2 表达无明显变化，p-ATM 和p-Chk2的蛋白水平降低，DDIT4的蛋白水平增加（P＜0.05），提示 miR-22 可能抑制了DDIT4 的表达，促进DNA损伤，见图10、11。

Figure 5. Cell cycle distribution in normal and high glucose concentrations after 24 and 48 h. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG group.图5 正常糖和高糖培养24和48 h后细胞周期分布的分析

Figure 6. The protein expression levels of DDIT4 in kidney tissues of NC group and DM group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NC group.图6 NC组和DM组小鼠肾组织中DDIT4蛋白表达水平的比较

Figure 7. The protein expression levels of DDIT4 in the NRK-52E cells of NG and HG groups. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG group.图7 NG组和HG组细胞中DDIT4蛋白表达水平的比较

讨 论

DKD 的发病机制较为复杂，涉及了肾脏血流动力学变化、氧化应激、炎症和肾素-血管紧张素-醛固酮系统过度活跃等［10］，其中高血糖引起的氧化应激是DKD 发展的关键因素，会导致蛋白氧化，脂质过氧化及 DNA 损伤的发生［11］。其中 DNA 损伤在 DKD病程进展中起着重要作用，ATM-Chk2 信号通路是DNA 损伤修复的信号通路之一，DSBs 时，ATM 会迅速磷酸化而活化下游的Chk2，导致细胞周期发生阻滞。本研究结果发现，高糖状态下肾小管上皮细胞p-ATM 和p-Chk2 的蛋白水平明显升高，细胞慧尾变长，细胞周期发生了阻滞，提示高糖促进肾小管上皮细胞发生DNA 损伤，且DNA 损伤修复通路ATMChk2被激活。

Figure 8. The protein levels of p-Chk2，p-ATM and DDIT4 under the condition of DDIT4 over-expression（DDIT4ov）. Con：control.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG+Con group；#P＜0.05 vs HG+Con group.图8 过表达DDIT4后p-Chk2、p-ATM和DDIT4蛋白水平的变化

Figure 9. The length of comet tail under the condition of DDIT4 over-expression（DDIT4ov）in NG group and HG group. Con：control. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG+Con group；#P＜0.05 vs HG+Con group.图9 正常糖和高糖过表达DDIT4后细胞慧尾长度的变化

DDIT4 是一种细胞内蛋白，其表达受几种细胞应激反应的调节，包括缺氧、内质网压力和DNA 损伤［12-13］。作为 DNA 损伤负调控因子，DDIT4 在高糖情况下的表达下降［14］，提示其可能参与DKD 时的DNA 损伤。我们的结果显示，高糖状态下，DDIT4 的表达降低；过表达DDIT4后，p-ATM 和p-Chk2的蛋白表达水平明显下降，细胞慧尾变短，提示DDIT4 能抑制高糖诱导的DNA 损伤，然而具体的调控机制尚不甚清楚。多项研究发现miRNA 可能通过靶向调控DDIT4 的表达发挥抑制 DNA 损伤修复作用［15-16］。在膀胱尿路上皮癌中，miR-22 可以负调控DDIT4 的表达［17］，而在 DKD 中，miR-22 是否同样发挥负调控DDIT4 的表达，抑制DKD 时DNA 损伤修复的作用不清楚。因此为了进一步验证此猜想，本研究在高糖状态下转染miR-22 mimics，观察到DDIT4 的表达受到明显抑制，且p-ATM 和p-Chk2 的蛋白水平明显升高；而转染 miR-22 inhibitor 后，DDIT4 的表达明显升高，p-ATM 和p-Chk2的蛋白水平受到抑制，这一结果提示miR-22可能通过靶向抑制DDIT4的表达进而抑制DNA损伤修复。

Figure 10. The protein levels of p-Chk2，p-ATM and DDIT4 under the condition of miR-22 over-expression（mimics）. Con：control.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG+Con group；#P＜0.05 vs HG+Con group.图10 过表达miR-22后p-Chk2、p-ATM和DDIT4蛋白水平的变化

Figure 11. The protein levels of p-Chk2，p-ATM and DDIT4 under the condition of miR-22 inhibition（inhibitor）. Con：control.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NG+Con group；#P＜0.05 vs HG+Con group.图11 抑制miR-22后p-Chk2、p-ATM和DDIT4蛋白水平的变化

综上所述，体内外高糖环境可导致DNA 损伤加重，高糖环境中大鼠肾小管上皮细胞DDIT4 的表达降低，过表达DDIT4 可以减轻DNA 损伤。miR-22 可靶向抑制DDIT4 促进糖尿病肾病肾小管上皮细胞DNA 的损伤，促进了 DKD 的发生发展，为 DKD 的治疗带来了新的启发和一定的实验依据。