miR-22通过靶向抑制DDIT4促进糖尿病肾病肾小管上皮细胞DNA损伤*

2021-12-06 05:16赵思琪李志阳肖雅文
中国病理生理杂志 2021年11期
关键词:高糖肾小管靶向

梁 丹, 赵思琪, 李志阳, 肖雅文, 丁 菁, 肖 瑛△, 郭 兵

(1贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室,贵州医科大学病理生理学教研室,贵州贵阳550025;2秦皇岛军工医院,河北秦皇岛066000)

研究发现,糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)患者由于持续的高血糖,肾小球系膜细胞中线粒体会产生氧化性DNA 损伤,毛细血管扩张性共济失调突变蛋白(ataxia telangiectasia mutated,ATM)-细胞周期检查点激酶2(checkpoint kinase 2,Chk2)信号通路是DNA 损伤中主要的修复通路之一[1]。ATM基因是参与DNA 损伤反应的重要基因,可以检测到DNA 双链断裂(double-strand breaks,DSBs),调节DNA损伤修复;Chk2基因是编码丝氨酸/苏氨酸激酶的一种肿瘤抑制基因,处于ATM基因的下游。DNA 的 DSBs 会导致 ATM 和 Chk2 持续磷酸化,激活ATM-Chk2通路来进行DNA 损伤修复[2]。研究发现,诸多因子参与了DNA 损伤修复过程,其中DNA 损伤诱导转录物 4(DNA damage-inducible transcript 4,DDIT4)已被证明能被DNA 损伤诱导,且DDIT4 对DNA 损伤有负调控作用[3]。在高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞及链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠模型中,DDIT4的表达均下调[4],提示 DKD 时的 DNA 损伤可能与DDIT4的减少有关,但具体机制仍不清楚。

微小RNA(microRNA,miRNA,miR)是一类非编码RNA,在DNA 损伤反应中起着重要的作用。最近的研究已经确定了几种miRNA 在DKD 肾脏纤维化中发挥着重要作用,参与了DKD 的病理过程[5-7]。有研究发现miR-22 与异常生理条件下DNA 损伤信号传导途径有着密不可分的联系,miR-22 能够抑制DNA 损伤修复[8]。另有研究报道,miR-22 在 DKD 大鼠的肾脏组织中表达上调,并通过靶向PTEN发挥抑制自噬作用,从而促进肾小管-间质纤维化[9]。上述研究表明,miR-22 可能成为DKD 中有吸引力的治疗靶标,且其作用机制可能与DNA 损伤修复密切相关。因此本研究旨在探讨DKD 时miR-22 能否靶向抑制DDIT4的表达,从而通过ATM-Chk2信号通路促进DNA 损伤,以期进一步阐明DKD 的发病机理,为预防DKD的进展提供新的理论依据。

材料和方法

1 动物和细胞

健康清洁级雄性C57BL 小鼠,体重(20±5)g,许可证号为SCXK(京)2016-0002,购自北京斯贝福生物技术有限公司。大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52E购自ATCC。

2 主要试剂

正常糖(normal glucose,NG;5.5 mmol/L 葡萄糖)培养基和0.25%胰蛋白酶购自HyClone;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自Biological Industries;DDIT4过表达质粒购自上海毅乐生物科技有限公司;miR-22 mimics 和inhibitor 购自广州瑞博生物科技有限公司;聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)购自Polyscience;兔抗Chk2 多克隆抗体购自Abcam;兔抗DDIT4、ATM、p-ATM 和 p-Chk2 多克隆抗体均购自上海爱必信生物科技有限公司;抗β-actin 单克隆抗体购自武汉普美克生物技术有限公司;ECL化学发光试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒和RIPA 裂解液等均购自碧云天公司;STZ 购自Sigma。电泳仪和转膜仪购自北京六一公司;凝胶成像系统购自Bio-Rad;高速低温离心机购自Eppendorf。

3 主要方法

3.1 动物造模及分组 将20 只C57BL 小鼠饲以标准饲料、自由饮水、适宜温度和湿度及每天12 h 照明,适应性喂养1 周后随机等分为正常对照(normal control,NC)组和DM 组。造模前1 d 称重,禁食4 h,造模方式为:DM 组小鼠连续5 d 腹腔注射STZ 溶液(50 mg·kg-1·d-1,溶媒为0.01 mol/L、pH 4.5的灭菌柠檬酸-枸橼酸钠缓冲溶液);NC组小鼠连续5 d腹腔注射等量溶媒。1周后尾静脉采血测空腹血糖,血糖值大于或等于16.7 mmol/L则视为造模成功。

3.2 NRK-52E 细胞的培养 将细胞接种于培养瓶内,放入恒温培养箱等待细胞贴壁,设定5% CO2,37 ℃恒温的培养条件,当细胞融合度达到80%左右时可进行传代并用于后续实验。将细胞分为高糖(high glucose,HG;30 mmol/L葡萄糖)组和NG组。

3.3 动物的处死和体液采集 成模16 周后处死各组小鼠,处死前1 d 用代谢笼收集24 h 尿液,记录尿量,收集的尿液离心后取部分上清送检;处死前禁食4 h,麻醉,称重,眼眶取血,4 000 r/min 离心10 min 分离血清,将血清置于-20 ℃冷冻保存;取血后剪开腹腔暴露双侧肾脏,在冰上轻柔去除肾脏外包膜,称取双侧肾脏重量后取一部分肾脏用4%中性甲醛固定,其余部分置于-80 ℃超低温冰箱冷冻保存。

3.4 动物生化指标的检测 用葡萄糖氧化酶法检测血糖(blood glucose,BG),脲酶连续监测法检测血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN),氧化酶法检测血清肌酐(serum creatinine,SCr),免疫比浊法检测尿微量白蛋白(microalbumin,MALB),氧化酶法检测尿肌酐(urine creatinine,U-Crea),邻苯三酚红钼法测尿总蛋白(urinary total protein,UTP)。以尿蛋白浓度乘以24 h尿量作为24 h UTP。

3.5 肾组织形态学观察 取部分4%中性甲醛固定的小鼠肾组织,用石蜡包埋后切片。脱蜡后进行HE染色,光镜下观察肾组织切片的形态学改变。

3.6 Western blot 检测小鼠肾皮质及NRK-52E 细胞中ATM、p-ATM、Chk2、p-Chk2 和DDIT4 蛋白水平称取 0.1 g 小鼠肾皮质,加入 500 μL 裂解液,在管内放入磁珠经组织研磨机研磨成液体,于4 ℃、12 000 r/min 离心30 min,吸取上清于新的EP 管中,即为所提取的蛋白溶液,BCA 法蛋白定量后,根据浓度加入适量的上样缓冲液,经SDS-PAGE、转膜、封闭后,分别加入Ⅰ抗(anti-DDIT4、anti-ATM 和 anti-p-ATM 均按 1∶2 000 稀释,anti-Chk2 和 anti-p-Chk2 按 1∶1 000稀释,anti-β-actin 按1∶5 000 稀释),4 ℃孵育过夜,次日回收Ⅰ抗,TBST 洗膜后,加入Ⅱ抗,室温孵育1 h,经ECL 显影液显影,成像仪曝光。所得蛋白条带用Image Lab 5.1软件分析处理。

3.7 彗星实验检测DNA的DSBs情况 提前准备好所需液体和制胶倒模,取正常熔点琼脂糖0.3 g 和50 mL PBS,微波炉中加热至沸腾,将正常熔点琼脂糖液倒入模具,待其凝固,放入烤箱内烘干12 h 以上,收取细胞悬液,取0.3 g 低熔点琼脂糖和50 mL PBS,加热至沸腾制备低熔点琼脂糖液,将细胞悬液与低熔点琼脂糖液按1∶1 混合,吹打混匀后迅速倒在第1层胶上。常温放置待其凝固,放入4 ℃冰箱冷却15 min以上,再倒入至少1 cm厚的裂解液,避光平放入 4 ℃冰箱,裂解 5~8 h,裂解后用 PBS 轻柔冲洗胶,于25 V、300 mA 电泳,完成后用中和液迅速冲洗2 次,风干5 min,再将胶转移到载玻片上,以5 mg/L的EB 染色液染色,避光风干5 min,镜下观察彗尾长度。

3.8 流式细胞术 收取细胞,用70%乙醇固定液充分重悬细胞,放入4 ℃冰箱固定24 h。800 r/min离心4 min,倒掉固定液,加入PBS 充分重悬细胞;800 r/min 离心 4 min,倒掉 PBS,加入周期试剂盒 PI 染色buffer、每管500 μL,避光常温放置15 min,选择相应检测指标和停止条件,设出对应的门,重悬细胞并放入样本夹,等待探针吸取细胞。将G1、S 和G2期细胞比例进行统计,判断细胞阻滞的周期。

4 统计学处理

Western blot 图像的数据提取使用Image Lab 软件。彗星实验图像的数据提取使用CASP 软件。实验数据均用SPSS 21.0软件进行分析处理,数据采取均数±标准差(mean±SD)形式。两组间的对比在正态性检验之后用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 DM小鼠生化指标的变化

DM 组小鼠BG、BUN、24 h MALB、24 h UTP、SCr和肾脏指数(kidney index,KI)均明显高于NC 组,见表1。

表1 NC组和DM组小鼠血糖、血尿素氮、24 h尿微量白蛋白、24 h尿总蛋白、血清肌酐和肾脏指数的变化Table 1. The changes of blood glucose(BG),blood urea nitrogen(BUN),24 h urinary microalbumin(MALB),24 h urinary total protein(UTP),serum creatinine(SCr)and kidney index(KI)in NC and DM groups(Mean±SD. n=6)

2 DM小鼠肾组织的病理变化

小鼠肾组织HE 染色后可见,NC 组小鼠肾小球形态较规则,肾小管结构清晰,间质无炎症细胞浸润;DM 组小鼠肾小管排列紊乱,且发生了萎缩,肾小管与基底膜有黏连,间质有炎症细胞浸润,见图1。

3 DM 小鼠肾皮质及HG 培养的NRK-52E 细胞中ATM、p-ATM、Chk2和p-Chk2蛋白水平的变化

Western blot 结果显示,与 NC 组相比,DM 组中的 ATM 和 Chk2 无明显变化,p-ATM 和 p-Chk2 蛋白水平增加(P<0.05);HG 组同NG 组比较也呈同样的变化,见图2、3。

Figure 1. The histomorphological changes of renal tissues in NC and DM groups.图1 NC组和DM组小鼠肾组织形态学变化

Figure 2. The protein levels of p-ATM and p-Chk2 in kidney tissues of NC and DM groups. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs NC group.图2 NC组和DM组小鼠肾组织中p-ATM和p-Chk2蛋白水平的变化

4 HG培养的NRK-52E细胞DNA的DSBs情况

彗星实验结果显示,与NG 组相比,HG 组细胞彗尾更长(P<0.05),DNA双链断裂程度加重,见图4。

5 HG培养后NRK-52E细胞发生了周期阻滞

与 NG 组相比,HG 培养 24 h 与 48 h 的细胞均发生了明显的细胞周期阻滞,HG 培养24 h后的细胞阻滞在G1期(P<0.05),HG 培养48 h 后的细胞阻滞在S期(P<0.05),见图5。

6 DM 小鼠肾皮质及HG 培养的NRK-52E 细胞中DDIT4表达水平的变化

Western blot 结果显示,与 NC 组相比,DM 组中的DDIT4 的蛋白表达降低(P<0.05);HG 组与NG 组比较也降低,见图6、7。

Figure 3. The protein levels of p-ATM and p-Chk2 in the NRK-52E cells of NG group and HG group. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs NG group.图3 NG组和HG组细胞中p-ATM和p-Chk2的蛋白表达水平

Figure 4. The length of comet tail in NG group and HG group. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs NG group.图4 正常糖和高糖组细胞慧尾长度的变化

7 HG 培 养 的 NRK-52E 细 胞 过 表 达 DDIT4 后ATM、p-ATM、Chk2和p-Chk2蛋白水平的变化

HG 培养的NRK-52E 细胞中过表达DDIT4 后,ATM 和Chk2表达无明显变化,p-ATM 和p-Chk2的蛋白水平明显降低(P<0.05),见图8。

8 HG培养的NRK-52E细胞过表达DDIT4使DNA的DSBs程度减轻

将分别转染DDIT4 空载质粒和DDIT4 过表达质粒的NRK-52E 细胞分别用NG 和HG 培养基培养,48 h 后收集活细胞,通过彗星实验检测结果显示,在过表达DDIT4 后,DNA 双链断裂的程度有所改善(P<0.05),见图9。

9 HG 培养的NRK-52E 细胞分别过表达和抑制miR-22 后 ATM、p-ATM、Chk2、p-Chk2 和 DDIT4蛋白水平的变化

HG 培养的NRK-52E 细胞中过表达miR-22 后,ATM 和Chk2表达无明显变化,p-ATM 和p-Chk2的蛋白水平增加,DDIT4 的蛋白水平降低(P<0.05);抑制miR-22 后,ATM 和 Chk2 表达无明显变化,p-ATM 和p-Chk2的蛋白水平降低,DDIT4的蛋白水平增加(P<0.05),提示 miR-22 可能抑制了DDIT4 的表达,促进DNA损伤,见图10、11。

Figure 5. Cell cycle distribution in normal and high glucose concentrations after 24 and 48 h. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs NG group.图5 正常糖和高糖培养24和48 h后细胞周期分布的分析

Figure 6. The protein expression levels of DDIT4 in kidney tissues of NC group and DM group. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs NC group.图6 NC组和DM组小鼠肾组织中DDIT4蛋白表达水平的比较

Figure 7. The protein expression levels of DDIT4 in the NRK-52E cells of NG and HG groups. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs NG group.图7 NG组和HG组细胞中DDIT4蛋白表达水平的比较

讨 论

DKD 的发病机制较为复杂,涉及了肾脏血流动力学变化、氧化应激、炎症和肾素-血管紧张素-醛固酮系统过度活跃等[10],其中高血糖引起的氧化应激是DKD 发展的关键因素,会导致蛋白氧化,脂质过氧化及 DNA 损伤的发生[11]。其中 DNA 损伤在 DKD病程进展中起着重要作用,ATM-Chk2 信号通路是DNA 损伤修复的信号通路之一,DSBs 时,ATM 会迅速磷酸化而活化下游的Chk2,导致细胞周期发生阻滞。本研究结果发现,高糖状态下肾小管上皮细胞p-ATM 和p-Chk2 的蛋白水平明显升高,细胞慧尾变长,细胞周期发生了阻滞,提示高糖促进肾小管上皮细胞发生DNA 损伤,且DNA 损伤修复通路ATMChk2被激活。

Figure 8. The protein levels of p-Chk2,p-ATM and DDIT4 under the condition of DDIT4 over-expression(DDIT4ov). Con:control.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs NG+Con group;#P<0.05 vs HG+Con group.图8 过表达DDIT4后p-Chk2、p-ATM和DDIT4蛋白水平的变化

Figure 9. The length of comet tail under the condition of DDIT4 over-expression(DDIT4ov)in NG group and HG group. Con:control. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs NG+Con group;#P<0.05 vs HG+Con group.图9 正常糖和高糖过表达DDIT4后细胞慧尾长度的变化

DDIT4 是一种细胞内蛋白,其表达受几种细胞应激反应的调节,包括缺氧、内质网压力和DNA 损伤[12-13]。作为 DNA 损伤负调控因子,DDIT4 在高糖情况下的表达下降[14],提示其可能参与DKD 时的DNA 损伤。我们的结果显示,高糖状态下,DDIT4 的表达降低;过表达DDIT4后,p-ATM 和p-Chk2的蛋白表达水平明显下降,细胞慧尾变短,提示DDIT4 能抑制高糖诱导的DNA 损伤,然而具体的调控机制尚不甚清楚。多项研究发现miRNA 可能通过靶向调控DDIT4 的表达发挥抑制 DNA 损伤修复作用[15-16]。在膀胱尿路上皮癌中,miR-22 可以负调控DDIT4 的表达[17],而在 DKD 中,miR-22 是否同样发挥负调控DDIT4 的表达,抑制DKD 时DNA 损伤修复的作用不清楚。因此为了进一步验证此猜想,本研究在高糖状态下转染miR-22 mimics,观察到DDIT4 的表达受到明显抑制,且p-ATM 和p-Chk2 的蛋白水平明显升高;而转染 miR-22 inhibitor 后,DDIT4 的表达明显升高,p-ATM 和p-Chk2的蛋白水平受到抑制,这一结果提示miR-22可能通过靶向抑制DDIT4的表达进而抑制DNA损伤修复。

Figure 10. The protein levels of p-Chk2,p-ATM and DDIT4 under the condition of miR-22 over-expression(mimics). Con:control.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs NG+Con group;#P<0.05 vs HG+Con group.图10 过表达miR-22后p-Chk2、p-ATM和DDIT4蛋白水平的变化

Figure 11. The protein levels of p-Chk2,p-ATM and DDIT4 under the condition of miR-22 inhibition(inhibitor). Con:control.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs NG+Con group;#P<0.05 vs HG+Con group.图11 抑制miR-22后p-Chk2、p-ATM和DDIT4蛋白水平的变化

综上所述,体内外高糖环境可导致DNA 损伤加重,高糖环境中大鼠肾小管上皮细胞DDIT4 的表达降低,过表达DDIT4 可以减轻DNA 损伤。miR-22 可靶向抑制DDIT4 促进糖尿病肾病肾小管上皮细胞DNA 的损伤,促进了 DKD 的发生发展,为 DKD 的治疗带来了新的启发和一定的实验依据。

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