利拉鲁肽通过cAMP/PKA/CREB 通路干预2型糖尿病大鼠骨质疏松的机制研究*

崇显瑾， 杨历新

（青海省人民医院内分泌科，青海西宁810007）

2 型糖尿病性骨质疏松（diabetic osteoporosis，DOP）是大多数糖尿病患者的严重并发症之一，临床症状以全身性骨显微结构受损、骨密度降低、骨量减少、骨强度减弱等为主，会大幅增加患者骨折风险［1-2］。高血糖可刺激活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量产生释放，诱导氧化应激水平显著升高，导致骨组织损伤及骨流失，是DOP的主要致病机制，减轻氧化应激，可改善糖尿病大鼠骨质疏松症状［3-4］。环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）/cAMP 反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）是细胞内调控过氧化与应激反应的经典信号途径，刺激其激活，可降低二氯乙酸诱导的氧化应激，起到神经保护作用，还可促进成骨细胞增殖和分化，改善骨质疏松症［5-6］，因而刺激cAMP/PKA/CREB 信号转导是一种很有前途的DOP 防治手段。利拉鲁肽是经典的胰高血糖素样肽1 类似物，可有效促进胰岛素合成分泌，降低血糖，增加DOP大鼠骨密度，改善其骨质疏松症状［7-8］，但利拉鲁肽治疗DOP的明确分子机制仍鲜有详尽报道，本项工作通过构建DOP 大鼠模型分析利拉鲁肽通过cAMP/PKA/CREB通路干预2型糖尿病大鼠骨质疏松的机制。

材料和方法

1 动物

70 只 SPF 级 SD 雌性大鼠，6～7 周龄，体重 180～220 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号为SCXK（京）2019-0008。所有大鼠在本院动物房中适应饲养，房内环境保持通风良好及清洁、安静，大鼠自由饮水进食，温度设定为23～26 ℃，相对湿度设定为52%～57%，12h/12h明暗循环照明。

2 主要试剂及仪器

利拉鲁肽（国药准字J20160037）购自诺和诺德公司；PKA 抑制剂N-［2-（对溴甲酰氨基）乙基］-5-异喹啉磺酰胺·2HCl 水合物｛N-［2-（p-bromocinnamylamino）ethyl］-5-isoquinolinesulfonamide·2HCl hydrate，H-89｝购自 MedChemExpress；链脲佐霉素（纯度HPLC≥99%）购自源叶生物有限公司；胎牛血清、DMEM 培养液和青霉素-链霉素溶液购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、D-无水葡萄糖和CCK-8 试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；ROS 试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒和cAMP 测试盒购自南京建成生物工程研究所；蛋白提取试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性测定试剂盒、BCA 蛋白检测试剂盒、羊抗兔Ⅱ抗及兔源β-tubulin、PKA、p-PKA、CREB 和p-CREB 抗体购自Abcam；增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒购自上海碧云天公司。

血糖仪（型号ACCU-CHEK）购自上海罗氏制药有限公司；微计算机断层扫描术（micro-computed to-mography，micro-CT）设备（型号Skyscan1172）购自北京悠然睿智系统技术有限公司；骨科生物力学测试仪（型号QX-W600）购自上海企想检测仪器有限公司；高温灰化炉（型号HF-2LC）购自郑州鑫涵仪器设备有限公司；全波长酶标仪（型号HBS-ScanX）购自南京德铁实验设备有限公司；蛋白电泳仪与转膜仪（型号Mini PROTEAN）购自Bio-Rad；化学发光扫描仪（型号C-DiGit）购自LI-COR。

3 方法

3.1 DOP 大鼠模型制备及分组给药 选取51 只大鼠参考文献［9］建立DOP大鼠模型：以高糖高脂饲料喂养SD 雌性大鼠，8 周后禁食不禁水12 h，腹腔注射30 mg/kg 链脲佐菌素，2 周后去除大鼠双侧卵巢，再过3 d 后测量大鼠空腹血糖水平，当空腹血糖≥16.70 mmol/L 时，表示DOP 大鼠模型建立成功。51只大鼠有3 只死亡，将存活的48 只造模成功大鼠随机分为模型组、利拉鲁肽组、H-89 组和利拉鲁肽+H-89 组，每组 12 只。另取 12 只雌性 SD 大鼠以普通饲料喂养，8 周后腹腔注射等剂量生理盐水，2 周后仅开腹，不摘除双侧卵巢，设为假手术组。

利拉鲁肽+H-89组大鼠以0.1 mg/kg的剂量皮下注射利拉鲁肽，4 周后以0.2 mg/kg 的剂量皮下注射给药［10］，同时以 5 mg/kg 的剂量腹腔注射 H-89［11］；利拉鲁肽组大鼠以0.1 mg/kg 的剂量皮下注射给药，4周后以0.2 mg/kg的剂量皮下注射给药，同时以与H-89 组相同的给药方法给予等体积生理盐水干预；H-89组大鼠以5 mg/kg 的剂量腹腔注射给药，同时以与利拉鲁肽组相同的给药方法给予等体积生理盐水干预；假手术组与模型组大鼠以与利拉鲁肽组相同的给药方法给予等体积生理盐水干预，同时以与H-89组相同的给药方法给予等体积生理盐水干预，每天一次，持续干预12周。

3.2 大鼠标本收集及股骨干骺端显微结构检测末次给药干预后24 h，以乙醚麻醉大鼠，通过注射器自颈动脉吸取血液2 mL，4 ℃、1 000×g离心，小心吸出上清，保存在-80 ℃。处死大鼠后取出两侧股骨，漂洗干净，取左侧股骨通过micro-CT 进行显微结构检测：将股骨放入刚性塑料管中，置于可自动旋转的转盘上，70 kV、200 μA、300 ms、14.8 μm/切片进行断层扫描，以股骨干骺端松质骨为感兴趣体积（volume of interest，VOI），运用仪器自带的重建软件进行图像重建分析，获得骨显微结构各参数——骨矿物质密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨体积分数（bone volume fraction，bone volume/total volume，BV/TV）和骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）。

3.3 大鼠股骨骨生物力学检测 大鼠左侧股骨在micro-CT 扫描后进行骨生物力学检测：将股骨水平放置在跨度为20 mm 的测试仪器两个支撑点上，以10 mm/min 的速率下压探头，至股骨中段断裂，通过仪器自带软件记录并分析得到弹性模量、最大载荷和屈服载荷3种骨生物力学指标数值。

3.4 大鼠骨矿盐含量检测 将3.2 中各组大鼠右侧股骨烘烤后测量其干重，再放入灰化炉中灰化，测量灰分重量，骨矿盐含量=灰分重量/干重。

3.5 大鼠血清 ROS、CAT、GSH-Px、MDA 和 cAMP 水平检测 取出3.2 中血清，提前以冰水浴冻融，运用试剂盒检测其中ROS、CAT、GSH-Px 和MDA 水平，具体参照说明书进行操作；通过酶联免疫吸附实验检测cAMP：取酶标板进行包被后，分组加样品血清，然后加酶标抗体37 ℃孵育0.5 h，洗涤，加底物液显色，加终止液终止反应，最后以酶标仪测定各孔吸光度（absorbance，A），根据说明书指导进行结果计算。

3.6 大鼠骨组织cAMP/PKA/CREB 通路蛋白表达检测 以刮匙刮取3.3 中左侧股骨断面处骨组织约0.5 g，应用试剂盒提取其中总蛋白并测量其浓度，经煮沸变性后，以20 μg 蛋白为一份进行等份分装，取出一份于120 V 恒压下电泳100 min 进行分离，然后将凝胶中蛋白于100 V 恒压下湿转70 min 转移至聚偏二氟乙烯膜上，使用5%脱脂奶粉溶液室温封闭膜上蛋白，分别剪下β-tubulin、PKA、p-PKA、CREB 和p-CREB 五种目的蛋白，以相应兔源Ⅰ抗4 ℃孵育，吸出Ⅰ抗后洗膜，使用合适Ⅱ抗室温孵育，吸出Ⅱ抗后洗膜，通过ECL 试剂盒显色，以化学发光扫描仪及Image Studio 5.2 软件可视化蛋白条带并进行定量分析，得到各蛋白相对表达水平。

3.7 大鼠股骨成骨细胞活力检测 取正常大鼠左侧股骨，浸泡在75%乙醇中消毒，以0.25%胰酶去除股骨结缔组织，然后剪碎，置于Ⅱ型胶原酶中消化，50 min 后终止消化，吹打混匀后过220 目网筛，以PBS 洗涤 3 次，以 5 mL 培养液（DMEM 培养基+1% 青链霉素混合液+10%胎牛血清）重悬细胞沉淀，接种在培养瓶中培养，传代4 代后得到纯化成骨细胞。将细胞以1×108L-1的密度接种在96 孔板，随机分为对照组、模型组、利拉鲁肽组、H-89 组和利拉鲁肽+H-89组，每组6个重复孔；另取6个孔不接种细胞，作为空白对照组。无菌培养12 h，模型组和药物处理组细胞以16.5 mmol/L 葡萄糖［12］处理，利拉鲁肽组以10 nmol/L 利拉鲁肽［12］处理，H-89 组以 2 mmol/L H-89［13］处理，利拉鲁肽+H-89 组以 10 nmol/L 利拉鲁肽和 2 mmol/L H-89 处理，48 h 后加入 CCK-8 试剂，1 h后以酶标仪检测各孔A值，再计算各组细胞相对活力（%）=（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。

3.8 大鼠股骨成骨细胞cAMP/PKA/CREB 通路表达检测 取传代的大鼠股骨成骨细胞，以1×108L-1的密度接种在24孔板，按照3.7中方法分组处理细胞，分别收集各组细胞培养液及细胞材料，以3.5 中方法测定细胞培养液中cAMP 水平，以3.6 中方法提取各组细胞中总蛋白，并检测PKA、p-PKA、CREB 和p-CREB蛋白相对水平。

4 统计学处理

以均数±标准差（mean±SD）表示计量资料，使用SPSS 24.0 软件对其进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 利拉鲁肽减少大鼠骨流失

与假手术组相比，模型组大鼠BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th 均显著降低（P＜0.05）；与模型组和利拉鲁肽+H-89 组分别相比，利拉鲁肽组大鼠BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th 均显著升高（P＜0.05），而H-89组大鼠BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th 均显著降低（P＜0.05），见图1及表1。

Figure 1. Three-dimensional micro-CT reconstruction of the rat femur in each group. A：sham operation group；B：model group，bone mineral density decreased and a large number of bone trabeculae disappeared；C：lilarulidide group，bone mineral density increased and the number of trabeculae recovered；D：H-89 group，bone mineral density became smaller and a large number of bone trabeculae disappeared；E：lilaruptide+H-89 group. The scale bar=2 mm.图1 各组大鼠股骨micro-CT三维重建图

表1 各组大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.ThTable 1. The BMD，BV/TV，Tb.N and Tb.Th of the rat femur in each group（Mean±SD. n=12）

2 利拉鲁肽改善大鼠股骨生物力学

与假手术组相比，模型组大鼠最大载荷、屈服载荷和弹性模量显著降低（P＜0.05）；分别与模型组、利拉鲁肽+H-89 组相比，利拉鲁肽组大鼠最大载荷、屈服载荷和弹性模量均显著升高（P＜0.05），而H-89 组大鼠最大载荷、屈服载荷和弹性模量均显著降低（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠股骨最大载荷、屈服载荷和弹性模量Table 2. Maximum load，yield load and elastic modulus of femur in each group（Mean±SD. n=12）

3 利拉鲁肽增加大鼠骨矿化

与假手术组相比，模型组大鼠骨矿盐含量显著降低（P＜0.05）；分别与模型组和利拉鲁肽+H-89 组相比，利拉鲁肽组大鼠骨矿盐含量显著升高（P＜0.05），而H-89 组大鼠骨矿盐含量显著降低（P＜0.05），见表3。

4 利拉鲁肽降低大鼠血清ROS水平

与假手术组相比，模型组大鼠血清ROS 水平显著升高（P＜0.05）；分别与模型组和利拉鲁肽+H-89组相比，利拉鲁肽组大鼠血清ROS水平显著降低（P＜0.05），而 H-89 组大鼠血清 ROS 水平显著升高（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠股骨矿盐含量及血清ROS水平Table 3. Bone mineral content of femur and serum ROS levels in each group（Mean±SD. n=12）

5 利拉鲁肽降低大鼠氧化应激水平

与假手术组相比，模型组大鼠血清CAT 和GSHPx 水平均显著降低，MDA 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组和利拉鲁肽+H-89组分别相比，利拉鲁肽组大鼠血清CAT 和GSH-Px 水平均显著升高，MDA 水平显著降低（P＜0.05），而 H-89 组大鼠血清 CAT 和GSH-Px 水平均显著降低，MDA 水平显著升高（P＜0.05），见表4。

表4 各组大鼠血清CAT、GSH-Px和MDA水平Table 4. Serum CAT，GSH-Px and MDA levels in rats of each group（Mean±SD. n=12）

6 利拉鲁肽激活大鼠cAMP/PKA/CREB 通路

与假手术组相比，模型组大鼠血清cAMP及骨组织p-PKA/PKA 和p-CREB/CREB 水平均显著降低（P＜0.05）；分别与模型组和利拉鲁肽+H-89组相比，利拉鲁肽组大鼠血清cAMP 及骨组织p-PKA/PKA 和p-CREB/CREB 水平均显著升高（P＜0.05），而H-89 组大鼠血清cAMP 及骨组织p-PKA/PKA 和p-CREB/CREB水平均显著降低（P＜0.05），见图2及表5。

表5 各组大鼠骨组织cAMP、p-PKA/PKA和p-CREB/CREB蛋白水平Table 5. The protein levels of cAMP，p-PKA/PKA and p-CREB/CREB in bone tissue of rats in each group（Mean±SD. n=12）

7 利拉鲁肽促进高糖诱导的股骨成骨细胞活力

与对照组相比，模型组大鼠股骨成骨细胞活力显著降低（P＜0.05）；分别与模型组和利拉鲁肽+H-89 组相比，利拉鲁肽组大鼠股骨成骨细胞活力显著升高（P＜0.05），而H-89 组大鼠股骨成骨细胞活力显著降低（P＜0.05），见表6。

表6 各组大鼠股骨成骨细胞活力Table 6. The viability of rat femoral osteoblasts in each group（Mean±SD. n=6）

8 利拉鲁肽激活大鼠股骨成骨细胞cAMP/PKA/CREB通路

与对照组相比，模型组大鼠股骨成骨细胞cAMP、p-PKA/PKA 及 p-CREB/CREB 水平显著降低（P＜0.05）；分别与模型组和利拉鲁肽+H-89 组相比，利拉鲁肽组大鼠股骨成骨细胞cAMP、p-PKA/PKA 及p-CREB/CREB 水平均显著升高（P＜0.05），而H-89组大鼠股骨成骨细胞cAMP、p-PKA/PKA 及p-CREB/CREB水平均显著降低（P＜0.05），见图3及表7。

表7 各组大鼠股骨成骨细胞cAMP、p-PKA/PKA和p-CREB/CREB蛋白水平Table 7. The protein levels of cAMP，p-PKA/PKA and p-CREB/CREB in rat femoral osteoblasts in each group（Mean±SD. n=6）

讨 论

随着社会发展及老龄化趋势加剧，我国DOP 病例逐年增加，因其致残的患者越来越多，极大降低患者生活质量，并给其家庭带来了沉重负担，因此找寻安全有效的DOP治疗手段是当今的临床医学研究热点［1-2，14］。本项工作对高糖高脂饲养 8 周的雌性大鼠腹腔注射链脲佐菌素合并摘除卵巢，来诱导建立DOP 模型，结果显示，建模大鼠骨密度减小，骨显微结构显著受损，骨生物力学性能减弱，骨矿化降低，呈现显著骨质疏松症状，表示DOP模型构建成功。

Figure 2. Western blot was used to detect the expression of cAMP/PKA/CREB pathway-related proteins in bone tissue of rats in each group. A：sham operation group；B：model group；C：liraglutide group；D：H-89 group；E：liraglutide+H-89 group.图2 各组大鼠骨组织cAMP/PKA/CREB 通路相关蛋白表达

有报道显示胰高血糖素样肽1 受体是2 型糖尿病的主要治疗靶点，利拉鲁肽作为该受体的一种激动剂，可显著降低并控制血糖，促进骨形成，减少骨吸收，抑制糖尿病引发的骨密度降低，缓解糖皮质激素及糖尿病导致的骨质疏松症［15］。本项工作采用利拉鲁肽处理DOP大鼠及股骨成骨细胞，结果显示，利拉鲁肽可提高成骨细胞活力，减轻DOP 大鼠骨显微结构损伤，升高BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th，改善骨生物力学性能，增强最大载荷、屈服载荷和弹性模量，提升骨矿化，增大骨矿盐含量。本研究进一步证实了利拉鲁肽可减少糖尿病导致的骨丢失，缓解其骨质疏松症状，对DOP具有明显的治疗功效，但其发挥作用的具体分子机制目前还未有确切详尽的阐述。

研究表明，DOP 的主要发病机制是高糖诱导产生的ROS引发高水平的氧化应激，造成骨代谢失衡，增强机体抗氧化活性，抑制氧化应激反应，可显著改善 DOP 骨流失症状［16-17］。cAMP 是细胞内调控 ROS产生及应激反应的信号分子，可促进下游PKA 和CREB 蛋白磷酸化，清除ROS，降低氧化应激水平，减轻2 型糖尿病诱导的神经毒性，还能促进成骨分化及骨形成，防治骨质疏松症［5-6，18-19］，而利拉鲁肽可通过激活cAMP 信号抑制淀粉样蛋白β 肽诱导的昼夜节律紊乱［20］，因此推测通过激活cAMP/PKA/CREB 信号减轻氧化应激可能是DOP 的药物防治机制之一。本项工作显示，DOP 大鼠体内氧化应激水平增强，抗氧化酶 CAT 和 GSH-Px 活性降低，cAMP/PKA/CREB信号处于抑制状态；利拉鲁肽可增强抗氧化酶活性，激活cAMP/PKA/CREB 信号，抑制ROS 产生及释放，减弱氧化应激反应，减轻大鼠骨质疏松症状；而以PKA 抑制剂 H-89 干扰 cAMP/PKA/CREB 信号传导，可加重DOP 大鼠骨量缺失及骨质疏松症状，并可减弱利拉鲁肽降低氧化应激的作用，逆转其对DOP 大鼠骨质疏松症状的缓解作用，表明利拉鲁肽是通过激活cAMP/PKA/CREB 信号而提高DOP 大鼠骨密度与骨生物力学性能，发挥减轻骨质疏松症状作用的。

Figure 3. Western blot was used to detect the expression of cAMP/PKA/CREB pathway-related proteins in rat femoral osteoblasts in each group. A：control group；B：model group；C：liraglutide group；D：H-89 group；E：liraglutide+H-89 group.图3 各组大鼠股骨成骨细胞cAMP/PKA/CREB 通路相关蛋白表达

综上所述，利拉鲁肽可升高cAMP 水平，促进PKA 和 CREB 磷酸化，抑制 ROS 产生，增强 DOP 大鼠抗氧化能力，减轻氧化应激反应，促使骨形成及骨矿化，减少骨量流失，提高骨密度，改善骨生物力学性能，最终起到对抗骨质疏松的作用；激活cAMP/PKA/CREB 信号是发挥其抗骨质疏松功效的分子机制之一。本文对DOP发病及药物治疗分子机制做出新的探讨，也为探寻更安全有效的DOP 防治措施提供了参考资料。