姜多糖的提取、结构表征和生物活性研究进展

景永帅，程文境，张钰炜，张瑞娟，张丹参，郑玉光，吴兰芳*

（1.河北科技大学化学与制药工程学院，河北石家庄050018；2.河北中医学院药学院，河北石家庄050200）

姜（Zingiber officinale Rosc.），又名白姜、均姜，是一种常用的药食两用资源，其根茎、叶均可入药，在我国资源丰富、栽种历史悠久。姜在中医临床应用中有生姜、干姜、炮姜等。其中，生姜是姜的新鲜根茎，早在梁代，陶弘景在《名医别录》便将生姜作为单独的一味药物，具有解表散寒、温中止呕、化痰止咳的功效，又可作烹调配料或制成酱菜、糖姜等；将生姜切片晒干或烘干后即得干姜，始载于《神农本草经》，其具有温中散寒，回阳通脉等功效[1]；干姜经砂烫法制得的炮制加工品即为炮姜，最早记载于东汉《伤寒论》，具有温经止血、温和止痛等功效[2]。

姜含有多种活性成分，如多糖、多酚、萜类、姜辣素及其衍生物等[3]，其中，姜多糖作为姜的有效成分之一，受到了研究人员的广泛关注。研究姜多糖的提取是对其深入研究及开发应用的基础，探究其最佳提取工艺，能够提高姜多糖的得率，进而降低成本，增加利用率。姜多糖的生物活性一般都依赖于其结构特征，多糖的单糖组成、糖苷键类型、空间构型等都是影响其活性的因素，对姜多糖结构的研究是其作为新型生物活性产品应用的先决条件。因此，该文对近几年国内外关于姜多糖提取工艺、结构特征以及药理活性等方面进行综述，以期能为提高姜及其多糖的有效利用以及深入研究姜多糖结构与活性的关系提供依据。

1 提取工艺

多糖是一类生物大分子，近几年来，科研工作者们对多糖的提取技术进行了系列的研究与探索，在传统溶剂提取法的基础上，建立了多种多糖的提取技术，如热水提取法（hot water extraction，HWE）、超声辅助提取法（ultrasonic assisted extraction，UAE）、微波辅助提取法（microwave assisted extraction，MAE）、酶辅助提取法（enzyme assisted extraction，EAE）等。除了上述提取方法外，还可以采用超高压提取法（ultra-high pressure extraction，UHPE）、超声细胞研磨提取法（ultrasonic cell grinder extraction，UCGE）、联合提取法等方法来提取多糖物质。姜多糖各提取法工艺优化参数见表1。

表1 姜多糖各提取法工艺优化参数Table 1 Optimization of extraction process parameters of ginger polysaccharide

Liao等[14]利用UCGE法提取生姜多糖，与HWE、EAE法相比，UCGE的多糖提取率最高，为（18.06±0.05）%。Chen等[11]分别应用热水浸提、碱溶液提取法提取生姜茎 叶 多 糖 （ginger stems and leaves polysaccharides，GSLPs），对比后发现，应用碱性溶液对其提取后所得多糖的提取率最高、生物活性最好。由此可知，可以通过改变溶剂的类型来提高多糖的提取率。Chen等[15]经UAE提取的姜渣多糖（ginger pomace polysaccharides，GPPs）的抗氧化活性均优于经HWE提取的GPPs。即UAE在提高多糖的提取率的同时，保证了GPPs拥有较高的抗氧化活性。

2 姜多糖的分离纯化

姜粗多糖中常含有蛋白质、色素及部分小分子物质，这些物质的存在会影响后续的结构分析和机制研究。姜多糖常用的除色素方法有活性炭吸附法、过氧化氢法、离子交换树脂法及大孔吸附树脂法等[16]。常用的除色素方法有Sevag法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法等[17]。对于无机盐、单糖和寡糖等小分子物质，可以采用透析、超滤等方法除去[11]。秦卫东等[18]考察了三氯乙酸法、鞣酸法和Sevag法对生姜多糖的蛋白脱除效果，结果表明鞣酸法的效果较好，脱除蛋白后的生姜多糖纯度为73%左右。

多糖进一步纯化的方法主要有大孔树脂柱层析法、离子交换层析法和凝胶柱层析法等[19]。在姜多糖的分离纯化过程中，若想达到样品的纯度要求，通常需要结合2种～3种分级纯化方法。表2总结了不同分离纯化方法的原理及其在姜多糖中的应用情况。

表2 多糖分级的方法及其在姜多糖中的应用Table 2 Classification of polysaccharides and its application in ginger polysaccharides

综上所述，DEAE-52纤维素离子交换柱、Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱、Sephadex G-200葡聚糖凝胶柱等为姜多糖常用的分离纯化手段。

3 姜多糖的结构分析

多糖的一级结构主要包括单糖组成、连接方式、排列顺序及单糖间糖苷键类型等。原料和提取方法的不同，所得多糖的测定结果也会有所不同，这些参数均与多糖的生物活性和功能性质密切相关。因此，多糖的结构分析是多糖研究的基本内容和主要难题之一，因此，对其结构进行分析和表征具有重要的作用。

根据已知报道的姜多糖的相关研究方法，整理总结了姜多糖的提取纯化与结构表征流程，见图1。

图1 姜多糖的提取纯化与结构表征流程图Fig.1 Flow chart of extraction，purification and structure characterization of ginger polysaccharide

3.1 姜多糖的分子量

多糖的生物活性与分子量有关，因此对姜多糖的分子量及其分布进行研究是十分必要的。姜多糖的分子量测定方法有高效凝胶渗透色谱法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）、凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography，GPC）。表3为不同研究者对姜多糖的分子量的测定结果。

表3 姜多糖的分子量测定Table 3 Determination of molecular weight of ginger polysaccharide

已有研究表明，小分子量的多糖的抗肿瘤活性较强[22]。Sun等[23]对比了不同分子量多糖的抗肿瘤活性，发现分子量最小的多糖组分具有较好的抗肿瘤作用，其分子量为6.53 kDa。Liao等[14]研究表明，姜多糖的分子质量分布范围较广，分布在11.81 kDa～1 831.75 kDa之间。

3.2 姜多糖的单糖组成

通常采用气相色谱法（gas chromatography，GC）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、高效毛细管电泳法（high performance capillary electrophoresis，HPCE）、薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）等对姜多糖的单糖组成进行分析。表4为姜多糖的组分名称、单糖组成及摩尔比和鉴别方法。

表4 姜多糖的单糖组成及表征方法Table 4 Monosaccharide composition and characterization of ginger polysaccharide

经对比后发现不同来源的姜多糖的单糖组成具有一致性，主要是由 Glc、Rha、Man、Gal、Ara 等按照不同比例组成，Chen等[11]试验结果表明，姜多糖中还存在少量的GlcA及GalA。

3.3 姜多糖的糖苷键连接方式

目前，通常采用化学分析与仪器分析联用的方法来测定多糖糖苷键连接方式。甲基化法是最常用的化学分析方法。仪器分析法包括核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、红外吸收光谱法（fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）等。Liao等[14]采用 HWE、EAE、UCGE 这 3 种方法提取生姜多糖，经DEAE-52纤维素阴离子交换柱、Sephadex G-200凝胶柱分离纯化后得到5种多糖组分，FT-IR测定结果表明，这5种多糖组分均为α型-吡喃糖；13C-NMR，1H-NMR测定UGP1主要以β-（1→6）-D-Galp聚合而成，UGP2主要以 α-（1→3）-LArap 聚合而成，EGP2主要以 β-（1→6）-D-Galp聚合而成，对比后发现，这5种多糖组分的结构具有相似性，由此可以预测姜多糖的大致结构为α-（1→4）-DGlpc及 α-（1→4）-D-Manp；经抗肿瘤活性分析后发现具有β-（1→6）-D-Galp的多糖具有较好的抗肿瘤活性[14]。具体糖苷键连接方式及表征方法如表5所示。

表5 姜多糖的糖苷键连接方式及表征方法Table 5 Glycosidic linkage and characterization of ginger polysaccharide

4 生物活性

姜多糖是姜中的有效成分之一，因其具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、止咳、抗疲劳等多种生物活性，成为了近年来的研究热点，并广泛应用于营养保健及制药工业中。

4.1 抗肿瘤活性

近年来，天然多糖因其优异的抗肿瘤活性和相对低的毒性以及对正常细胞无明显的副作用而受到研究者的广泛关注。Cheng等[26]研究了鲜姜、干姜和蒸姜对人的Hela癌细胞的抗增殖作用的影响。结果表明，蒸姜在120℃、4 h时的抗Hela癌细胞增殖作用分别比干姜和鲜姜高出了1.5倍和2倍。Sun等[23]经提取分离纯化后获得了不同分子量的多糖，发现低分子量多糖具有较好的抗肿瘤作用。Liao等[14]经超声波细胞粉碎机提取的生姜多糖（UGP1和UGP2），与其它3种纯化多糖相比，UGP1和UGP2对H1975、B16和MCF-7型肿瘤细胞增殖的抑制作用没有较大差别，但在相同剂量下，相对分子质量较小且具有β-（1→6）-D-Galp结构的UGP1对HCT116型肿瘤细胞的抑制率较高，具有较好的抗肿瘤活性。Wang等[25]运用MTT法、细胞形态观察、细胞核形态观察、活性氧观察等方法测定生姜多糖的抗肿瘤活性，结果显示，生姜多糖（neutral ginger polysaccharide fraction，NGP）对 HepG2 细胞活性有明显的抑制作用，当其浓度为0.4 mg/mL时，对HepG2细胞的抑制率高达49.63%，并且发现GP是通过下调 Bcl-2mRNA 表达，上调 Bax、Fas、Fasl、p21、p53、caspase-3 mRNA表达来诱导HepG2细胞凋亡，进而发挥抗肝癌活性。Yang等[27]发现生姜多糖对体外培养的RAW264.7细胞有显著的免疫活性，对巨噬细胞的增殖、免疫物质（NO、TNF-α、IL-1β 和 IL-6）的产生起到了明显的促进作用；在NGP的浓度为200 μg/mL时，NO、TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的分泌量分别为29.41 μmol/L、1 496.71、44.30、1 889.83 pg/mL，因此NGP可能成为一种潜在的免疫剂，为进一步的链构象和免疫机制研究提供了有意义的信息。

4.2 抗氧化活性

多糖的抗氧化活性受多种综合因素的影响，如糖醛酸含量、分子量、单糖组成、硫酸化程度、糖苷键类型等。目前已有报道表明，糖醛酸含量高、分子量小的多糖通常具有更显著的抗氧化活性[28]。Chen等[11]采用自由基清除活性法测定了4种姜多糖样品体外抗ABTS+自由基、DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力，以及亚铁离子的螯合活性和还原能力，结果表明，ASE-GSLP的抗氧化能力最强，分子量最小，糖醛酸含量最高，为6.266%。Zhang等[29]以生姜多糖为研究对象，采用不同体外培养体系对其抗氧化活性进行研究，发现3种样品均具有一定的抗氧化活性，其中G2的分子量较低、糖醛酸含量（7.45%）较高。夏宇[30]发现生姜皮多糖GE1、GE2、GE3具有一定的抗氧化活性，并随其浓度的增加而加强，其中GE2的抗氧化能力最强，分子量（194 kDa）最小。

4.3 降血糖作用

多糖可通过促进胰岛素分泌、改善胰岛素抵抗及调节相关酶活性这3种途径来降低血糖。Chen等[11]将提取的GSLPs作为口服降糖药物应用于高血糖患者，并测试其作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的疗效，结果发现，经HWE、UAE、ASE、EAE这4种方式提取的GSLP对α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈剂量依赖性，IC50值由小到大排序如下：ASE-GSLP＜EAE-GSLP＜UAE-GSLP＜HWE-GSLP，由此可知，ASE-GSLP和HWE-GSLP对α-葡萄糖苷酶分别表现出最强和最弱的抑制作用，这可能与它们的糖醛酸含量有关，糖醛酸含量高的对α-葡萄糖苷酶的抑制活性较强。虽然作为抑制能力最强的多糖组分，ASE-GSLP的抑制能力仍低于阿卡波糖，但这些特性仍然可表明GSLPs具有作为有效的糖尿病抑制剂的潜力。此外，α-葡萄糖苷酶抑制活性归因于多糖中存在游离羧基和羟基，它们可与消化酶的氨基酸残基相互作用导致酶失活[28]；并且带较多电荷的多糖更容易与α-葡萄糖苷酶形成络合物，更容易限制酶的活性[31]。因此，ASE-GSLP对α-葡萄糖苷酶抑制活性最高可能是由于其分子量较小，糖醛酸、硫酸盐含量较高，并且结构中还存在游离羧基和羟基。

4.4 镇咳作用

已有研究表明天然来源的多糖具有镇咳作用[32-34]。Bera等[35]报道了姜多糖（water extracted polysaccharides，WEP）的镇咳作用，以豚鼠为实验对象，用胸腺谱仪测定了WEP的镇咳活性，结果发现WEP能显著抑制实验性诱发的豚鼠咳嗽反射，没有明显改变气道平滑肌的收缩功能，诱导止咳活性而不上瘾，这与临床常用的止咳药磷酸可待因相近，且未出现显著的毒性或副作用；对其结构分析后发现，WEP主要是由葡聚糖和少量GalA构成，因此推测葡聚糖也有一定的镇咳作用。

4.5 其它活性

除了以上生物活性以外，姜多糖还具有抗疲劳[12]、保护脑缺血损伤[36]等生物活性，还可用做血栓的抗凝剂和治疗试剂[37]。

5 构效关系分析

对姜多糖结构的解析显示，发现其分子量分布在5.277 kDa～1 981.265 kDa 之间，主要由 Glc、Rha、Man、Gal、Ara等按照不同比例组成，具有吡喃糖构型，并还可能含有少量的GlcA及GalA；其中，分子量、糖苷键类型及糖醛酸含量等对姜多糖的生物活性影响较大，通常分子量小、糖醛酸含量较高的姜多糖具有较强的抗氧化、抗肿瘤、降血糖及镇咳活性。Sun等[23]对比了不同分子量姜多糖的抗肿瘤活性，发现分子量最小的姜多糖组分（6.53 kDa）具有较好的抗肿瘤作用，另有研究表明，存在 β-（1→6）-D-Galp 或三螺旋结构[25，38]的姜多糖组分的抗肿瘤活性较强。

6 讨论与总结

近年来，国内外学者对姜多糖的提取工艺、分离纯化、结构和药理作用机制的研究越来越广泛，因此本文对姜多糖的提取方法、结构及其生物活性进行总结。综上可以看出姜多糖最常用的提取方法是热水回流提取法，在此基础上，运用辅助手段如超声提取、微波提取、酶提取来改进提取工艺，有效提高了姜多糖的提取效率。姜多糖在疾病预防及保健品开发等方面有广阔的应用前景，具有抗氧化、抗肿瘤、调节血糖和镇咳等多种生物活性，对这些活性作用产生影响的因素可能是其分子量、糖醛酸含量、糖苷键的连接方式等。但目前，姜多糖的提取纯化手段仍不成熟，对其高级结构及作用机制研究较少、生物活性研究多停留在体外及动物实验等；今后，应对姜多糖的提取工艺优化及与其成分含量变化等进行系统研究，形成更加标准、可控的制备工艺；借助现代分析技术对姜多糖结构与生物活性的关系进行深入研究，明确其物质基础及构效关系；利用转录组测序、蛋白质组定量和修饰分析等前沿技术阐释姜多糖生物活性的分子机理，比如抗肿瘤、免疫调节、抗衰老和镇咳作用相关的基因表达和信号调控途径，为姜多糖更好的在食品、保健食品和医药领域的开发和利用提供科学依据。