鲮鱼糜致腐微生物分离及其复合生物防腐剂研究

柏建玲，王惠惠，蔡淑珍，莫树平，杨小鹃，何莹龙，苏悦，吴清平

（广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室广东省微生物安全与健康重点实验室，广东广州510070）

鱼类含有丰富的蛋白质且肉质细腻，在贮藏、运输、加工及销售过程中极易腐败变质，从而导致资源浪费和环境污染[1-2]。鲮鱼（Cirrhinus molitorella）是广东省大宗淡水养殖产品，它具有生长快、养殖成本低、产量大、肉质细嫩、营养丰富等特点。鲮鱼个体小、骨刺多，因此一般被制作成鱼糜、鱼丸等产品销售[3-4]。国内外学者通过对水产食品腐败微生物研究发现，水产食品所含微生物中只有部分微生物参与腐败过程，因此提出了特定腐败菌的概念，特定腐败菌的生长繁殖在很大程度上起着主导腐败变质的作用[5-7]。鱼类防腐保鲜主要通过低温冷冻和添加化学防腐剂，低温冷冻成本高且影响产品品质，化学防腐剂存在严重安全隐患[8-9]。而多数鱼肉产品天然生物防腐剂仍处于研究阶段[10]。

ε-聚赖氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一种天然防腐剂，具备广谱、水溶性及稳定性好等优点，我国已批准其在部分食品中使用[11-13]。将具备抑菌效果的物质按照一定比例复配使用，可以提高水产品及其制品的保鲜效果[14-15]。研究发现，将乙二胺四乙酸二钠、乳酸链球菌素（Nisin）和纳他霉素复合使用，可抑制水产品中革兰氏阴性菌的生长[16-17]；此外，利用壳聚糖成膜特性，与ε-聚赖氨酸复合使用可以延长南美对虾的储存期[18]。关于复合生物防腐剂的研究报道较多，然而复配剂在食品防腐中所起的作用未引起人们的足够重视，且针对其防腐增效机理和抑菌谱扩展机理缺乏系统的研究[19-23]。因此，本文应用微生物学方法从鲮鱼鱼糜中分离腐败微生物，将其作为研究对象，应用ε-聚赖氨酸和不同增效剂进行抑菌试验研究，筛选最佳配比控制水产品中腐败微生物的生长，以达到防腐保鲜、延长食物货架期的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

鲮鱼鱼糜：市售，放置于4℃冰箱保存备用；ε-聚赖氨酸：浙江新银象生物工程有限公司；甘氨酸（生物试剂，99%）、L-丙氨酸（生物试剂，98.5%）：上海源叶生物科技有限公司；L-苹果酸（生物试剂，98%）：大连美仑生物技术有限公司；乙二胺四乙酸二钠（ethylene diamine tetraa-cetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、乳酸钠、柠檬酸钠（分析纯）：广州化学制剂厂；肉汤培养基、营养琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基：广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 试验菌种

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC2593）、铜绿假单胞菌（Pseudmonas aeruginosa CMCC10104）、大肠杆菌（Escherichia coli ATCC25922）：广东省科学院微生物研究所菌种保藏中心提供；库尔特氏杆菌（Kurthia gibsonii YB12）、小穗葡萄球菌（Staphylococcus sciuri YB13）、溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus YM14）、黄体微球菌（Micrococcus luteus YM31）、喜马偕尔邦考克氏菌（Kocuria himachalensis YM35）：广东省科学院微生物研究所微生物安全与健康中心实验室分离鉴定保存。

1.3 致腐微生物分离鉴定方法

轻度腐败的鲮鱼鱼糜样品均质处理后，采用稀释平板分离法，取0.1 mL菌悬液分别稀释后（10-1、10-2、10-3）涂布于肉汤培养基上，30℃培养48 h。对分离得到的单菌落通过菌株培养特征、生理生化试验及16S rRNA分子鉴定法进行鉴定。

1.4 增效剂筛选

1.4.1 复合生物防腐剂配制

选择7种可能对生物防腐剂具有增效作用的增效剂进行筛选试验，将增效剂按照比例分别与ε-PL复配形成复合生物防腐剂，具体配方为配方1（ε-PL0.5g/kg、EDTA-2Na 0.5 g/kg）、配方 2（ε-PL 0.5 g/kg、柠檬酸钠0.5 g/kg）、配方 3（ε-PL 0.5 g/kg、L-丙氨酸 0.5 g/kg）、配方4（ε-PL 0.5 g/kg、甘氨酸 0.5 g/kg）、配方 5（ε-PL 0.5g/kg、L-苹果酸0.5g/kg）、配方 6（ε-PL0.5g/kg、乙酸钠 0.5g/kg）、配方 7（ε-PL 0.5 g/kg、乳酸钠 0.5 g/kg），CK1（空白）、CK2（0.5 g/kg ε-PL）。通过防腐试验，筛选最佳螯合增效剂及合适浓度。

1.4.2 复合生物防腐剂的抑菌测定

复合生物防腐剂对试验菌株的抑菌测定采用牛津杯法。配制培养基，倒平板，制备指示菌菌悬液，取适量指示菌菌悬液涂布于指示菌平板上，放置牛津杯，分别添加125 μL1.4.1配制好的7种复合生物防腐剂及 CK1、CK2，在 30 ℃条件下培养 24 h～72 h，观察结果，测量并记录抑菌圈直径。

TWEAK上游引物5′-ATCGCAGCCCATTATGAAGT-3′、下游引物 5′-GAAGAGTCCGAAGTAGGTGAGG-3′，p38MAPK 上游引物 5′-TCGAGACCGTTTCAGTCCAT-3′、下游引物5′-CCACGGACAAATATCCACT-3′，GAPDH上游引物5′-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′、下游引物5′-CCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 鲮鱼鱼糜防腐应用试验

1.5.1 鲮鱼鱼糜防腐处理方法

分别将复合生物防腐剂添加至鲮鱼鱼糜样品中，不添加复合生物防腐剂作为对照组。经过处理的鱼糜样品放置在4℃冰箱进行贮藏试验，每天取样测定挥发性盐基氮和菌落总数。每个处理重复3次。复合生物防腐剂配制见表1。

表1 复合生物防腐剂配制Table 1 Compound bio-preservation preparation

1.5.2 检测项目

挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）：按照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮》方法进行测定；菌落总数：按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数》方法进行测定。

1.6 数据处理

所有结果均使用SPSS17.0软件进行数据分析，采用SigmaPlot 12.5软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 鲮鱼鱼糜致腐微生物的分离鉴定

从市售的鲮鱼鱼糜中分离致腐微生物9株，将菌株 编 号 为 YB12、YM15、YB13、YM13、YM14、YM31、YM35、YM32、YM36，菌落形态见图 1。

图1 鲮鱼鱼糜致腐微生物的菌落形态Fig.1 The colony morphology of mud carp surimi spoilage microorganisms

从图1可以看出，分离筛选致腐微生物主要为细菌，菌落形状均为圆形，具有光泽，菌落表面呈隆起状。菌落边缘呈圆润光滑状，菌落不透明，颜色主要为黄色和乳白色。

表2 鲮鱼鱼糜致腐微生物鉴定结果Table 2 Identification results of spoilage microorganisms in mud carp surimi

如表2所示，分离鉴定了9株优势腐败菌，分别为YB12、YM15、YB13、YM13、YM14、YM31、YM35、YM32、YM36。其中革兰氏阳性菌6个，占66.7%；革兰氏阴性菌3个，占33.3%。

2.2 增效剂的筛选

根据鲮鱼鱼糜优势致腐微生物鉴定结果，选择分离鉴定的 5 株优势致腐微生物：YB12、YB13、YM14、YM31、YM35和3株标准菌株：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC2593）、铜绿假单胞菌（Pseudmonas aeruginosa CMCC10104）、大肠杆菌（Escherichia coli ATCC25922）作为指示菌，进行生物防腐剂ε-PL增效剂的筛选。将7种增效剂分别与ε-PL复配，测试其对指示菌的抑制情况，测量并记录抑菌圈直径，结果见图2。

图2 螯合增效剂分别与ε-聚赖氨酸复合对指示菌的抑制作用结果Fig.2 The results of the inhibitory effects of synergist agent compounded with ε-polylysine on indicator bacteria

由图2可知，L-丙氨酸、甘氨酸、L-苹果酸对ε-PL具有较强的增效作用，与ε-PL形成的复合生物防腐剂对鱼糜中几种指示菌及标准菌株均有不同程度的抑制作用，复合生物防腐剂可能破坏了指示菌细胞膜的完整性，引起细胞膜的通透性增加，造成胞内物质如核酸、蛋白质等成分泄漏，细胞凋亡率增加，从而达到抑菌效应。根据试验结果，结合对鱼肉风味的影响，选取L-丙氨酸、甘氨酸、L-苹果酸3种增效剂进行后续试验研究。

2.3 复合生物防腐剂对鲮鱼鱼糜致腐微生物抑菌试验

通过最佳配方研究获得复合生物防腐剂配方2个（1#、2#），以本实验室分离保存的3株标准菌株及分离的5株鲮鱼鱼糜优势致腐微生物为指示菌，测定复合生物防腐剂的抑菌效果见图3。

图3 研制复合生物防腐剂对分离冷鲜鱼致腐微生物抑制效果Fig.3 The inhibitory effects of the developed compound biological preservation on the decaying microorganisms of separated chilled fish

由图3可知，2种复合生物防腐剂对3株标准菌株和分离的5株冷鲜鱼优势致腐微生物菌株均具有较好的抑制作用，抑菌效果明显优于单独使用ε-聚赖氨酸。

2.4 样品菌落总数的测定

鲮鱼鱼糜样品经复合生物防腐剂处理后，4℃冰箱贮藏过程中菌落总数变化见图4。

图4 鱼糜样品菌落总数变化情况Fig.4 Changes in the total number of colonies of mud carp surimi

由图4可知，随着贮藏时间的增加，CK1与CK2组的鱼糜样品菌落总数均呈现上升趋势；CK1在第7天时菌落总数达到 7.40 lg（cfu/g），而添加 1#、2# 复合生物防腐剂的鱼糜样品在贮藏前7 d菌落总数整体均处于一个较低的水平。鱼糜样品贮藏至第10天，1#、2#处理组菌落总数出现明显的上升，分别为6.79 lg（cfu/g）和5.43 lg（cfu/g）。结果表明，2#复合生物防腐剂处理的鱼糜样品菌落总数均最低，防腐效果最好。

2.5 样品挥发性盐基氮的测定

挥发性盐基氮是评价鱼肉鲜度的主要指标，鱼糜在贮藏过程中，微生物和酶会引起蛋白质分解而产生氨以及胺类等含氮物质，其含量越高，表明氨基酸被破坏的越多，鱼糜腐败程度越为严重[21]。各处理组中挥发性盐基氮含量如图5所示。

图5 鱼糜样品挥发性盐基氮变化情况Fig.5 Changes of volatile based nitrogen in mud carp surimi

由图5可知，随着贮藏时间的增加，对照组与添加复合生物防腐剂的鱼糜样品挥发性盐基氮均呈现上升趋势；添加1#和2#复合生物防腐剂的鱼糜样品挥发性盐基氮含量整体均低于CK1和CK2，与鱼糜样品菌落总数变化情况趋势一致。其中，2#处理鱼糜样品中挥发性盐基氮含量在第8天时为25.42 mg/100 g，而对照组CK1达到32.35 mg/100 g，表明ε-PL、甘氨酸、L-苹果酸复配使用能明显抑制腐败菌的生长，延长鱼糜产品的贮藏时间。

3 结论

鲮鱼鱼糜具有肉质细嫩、营养丰富、水分含量高等特点，在贮藏、运输、加工处理及销售过程中极易腐败变质，从而导致资源浪费和环境污染。本文采用微生物学方法从鱼糜中分离筛选出9株优势致腐微生物，通过分子鉴定，造成鱼糜腐败多为革兰氏阳性菌。应用不同生物增效剂与ε-PL复配使用，研究复合生物防腐剂对3种标准菌株及5株优势致腐微生物菌株的抑菌效应，通过筛选优化复配剂，采用ε-PL、甘氨酸、L-苹果酸复配使用能明显抑制致腐微生物的生长，降低贮藏期间鱼糜中菌落总数及游离氨基氮的产生。本研究为延长鱼糜的贮藏时间，为鱼糜的保鲜技术应用提供研究基础。