混合酵母发酵对火龙果酒发酵特性及风味特征的影响

林亚兰，张爱华

（1.常州大学石油化工学院，江苏常州213164；2.常州大学城乡矿山研究院，江苏常州 213164）

我国火龙果酒的生产过程多采用商用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行单菌发酵，酿酒酵母在酒精发酵过程中耐高酒精、高温，有良好的发酵活性，可以确保果酒品质的稳定，但由于酿酒酵母代谢产物中挥发性香味物质种类少且含量低，缺乏酯类香味物质，不能很好地体现果酒的复杂性和典型性[1-2]，难以满足消费者需求。大量研究表明，非酿酒酵母在葡萄酒酿制过程中，通过与酿酒酵母的共同发酵来控制酒体不理想的风味或者降低乙醇含量来赋予葡萄酒复杂的香气，从而增加葡萄酒感官质量特征的复杂性。这类酵母与酿酒酵母不同，它们可以产生大量的风味物质，对果酒品质有着积极的影响[3-5]。柠檬形克勒克酵母（Klockera apiculata）和东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）具有高产β-葡萄糖苷酶的能力[6]，挥发性香气形成主要依靠β-葡萄糖苷酶水解香气糖苷[7]，β-葡萄糖苷酶具有独特的水解活性，可以从香气前体物质的末端非还原性β-D-糖苷键中释放出非还原性糖基，赋予葡萄酒更好的花香、果香味[8]。葡萄汁由孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）与酿酒酵母的混种发酵可有效改善果酒的品质和风味[9-10]。在麦芽汁中接种德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）增加了乙酸乙酯和乙酸异戊酯含量[11]，在果酒酿造过程中添加Torulaspora delbrueckii可以提高生物风味并减少乙醇含量[12]。对于既不含有机酸，也不含酯类芳香因子的毫无风味的火龙果而言，在酿造火龙果酒时可以引用非酿酒酵母来提升果酒风味，以此提高火龙果酒的品质。

我国火龙果酿造产业刚刚起步，非酿酒酵母在火龙果酒酿制过程中的作用尚未见报道，因此本研究选用非酿酒酵母德尔布有孢圆酵母与酿酒酵母混合，通过对火龙果酒发酵特性、香气成分进行研究，探讨德尔布有孢圆酵母相关代谢物对火龙果酒风味及感官特性的影响，以期为生产高质量火龙果酒提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜火龙果：贵州罗甸红心火龙果；德尔布有孢圆酵母PRELUDE（非酿酒酵母）：CHR HANSEN公司；德尔布有孢圆酵母NS-D（非酿酒酵母）：安琪酵母公司，购入为活性干酵母；酿酒酵母RB2、X16、焦亚硫酸钾（potassium metabisulfite，PMS）、酒石酸、果胶酶（3 280 U/g，以半乳糖醛酸计）、碳酸氢钾、酵母营养助剂（均为食品级）：法国Laffort公司。

1.2 仪器与设备

PAL-1手持糖度计：日本ATAGO公司；DMA35手持酒精测试仪：奥地利安帕公司；GC-MS-QP2010PLUS气相质谱联用仪：日本岛津仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 火龙果酒加工工艺流程

火龙果酒发酵工艺流程见图1。

图1 火龙果酒发酵工艺流程Fig.1 The fermentation process of pitaya wine

选择成熟度高、无霉烂变质及无病虫害的新鲜火龙果，用1%H2O2冲洗、去皮，将果肉打浆。根据果浆的质量添加果胶酶（3 g/100 kg），14℃～16℃条件下酶解24 h，纱布过滤除去果渣，根据所得的果汁体积添加蔗糖调整火龙果汁的糖度。接种前添加25 mg/L的SO2（以PMS的形式添加）。将4种酵母RB2、X16、PRELUDE、NS-D按3 g/L于30℃条件下用去离子水活化30 min，水体积为酵母体积20倍，当酵母产生丰富气泡时加入几滴火龙果汁进行酵母训化，将活化好的酵母接种在火龙果汁中，在16℃条件下进行恒温发酵，每天测定糖度、pH值等变化直至主发酵结束（当火龙果酒酒体表面无气泡产生，酵母生长量、残糖含量与酒精度等趋于稳定说明主发酵结束）。主发酵结束后，将火龙果酒经滤网过滤澄清，移入新的发酵容器于4℃进行低温陈酿，陈酿结束后移入容器储存。

1.3.2 发酵性能试验

将火龙果汁进行成分调整，最终白利糖度（Brix）为22°Bx，pH值为3.8，将果汁均分为8份，在20 L的不锈钢发酵桶中进行酒精发酵。酵母接种活菌数量为1×106CFU/mL，发酵温度为16℃。分别进行酿酒酵母（RB2、X16）和非酿酒酵母（PRELUDE、NS-D）的简单发酵与混合发酵，混合发酵编号为CF1（RB2+PRELUDE）、CF2（RB2+NS-D）、CF3（X16+PRELUDE）、CF4（X16+NS-D）。

混合酵母发酵试验与单菌酵母发酵试验同时进行，混合酵母按体积比1∶1接种。每24 h收集一次样品，测定pH值、酒精度、糖度。

1.3.3 香气成分分析

火龙果酒香气成分萃取：准确量取50 mL酒样，倒入分液漏斗中，用20 mL二氯甲烷分别萃取3次，每次摇动5 min，待静置分层后分离出下层二氯甲烷相，将3次萃取后的二氯甲烷合并，在旋转蒸发仪上浓缩至 1 mL，供气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析。气相色谱条件：毛细管柱VF-WaX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度230℃；载气为氦气；流速 1 mL/min；进样量 2 μL；不分流；柱温程序：60℃保持2 min，以10℃/min升至150℃保持2 min，再以8℃/min升至210℃保持20 min。质谱条件：电子碰撞源；电子能量70 eV；离子源温度230℃；传输线温度250℃；扫描范围m/z 40～450。

采用Xcalibur2.0版本软件及NST2008谱图库进行火龙果酒香气成分的检索鉴定，兼顾保留时间进行鉴定，采用内标法（2-辛醇）进行各组分定量。

1.3.4 感官评价

参考刘文丽等[13]的方法，挑选6名训练有素的食品专业人员作为评定人员，其中3女3男，年龄在20岁～30岁之间，试验在常州大学中澳果酒实验室的标准品酒室完成，试验重复3次。所有感官评价采用定量描述分析法（quantitative descriptive analysis，QDA），选取 10点制标度：0～9（香气：0=没气味，9=气味最强；颜色：0=无颜色，9=颜色最深；味道：0=没味道，9=味道最强）。

1.3.5 数据处理

采用软件Origin 2018作图，SPSS 23.0进行数据处理，应用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan法差异分析，P＜0.05，差异显著；对8种火龙果酒香气成分的含量进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中糖度、酒精度和pH值变化

不同发酵体系中火龙果酒理化指标见图2。

图2 不同菌种发酵体系中糖度、酒精度、pH值的变化Fig.2 Changes in total sugar content，ethanol content，and pH in different fermentation systems

从图2可以看出，不同菌种及其混合发酵方式下发酵液的糖度变化趋势相同，发酵前期糖度下降速率快，后期下降平缓，直至发酵结束糖度基本不变。非酿酒酵母PRELUDE和NS-D对糖的利用率低于酿酒酵母，在发酵结束时糖度仍保持较高的水平，混合发酵对糖的利用率接近单菌酿酒酵母发酵。

糖是酒精发酵的基质，酵母通过呼吸作用将糖转变为乙醇和其他副产物，不同发酵体系的酒精变化与其糖度变化是相应的。由图2可知，酿酒酵母发酵的酒精度高达11.7%vol，而德尔布有孢圆酵母由于只能利用发酵液中的葡萄糖、果糖和蔗糖，不能分解麦芽糖、麦芽三糖，因而产酒精能力较弱[14]，PRELUDE和NS-D酒精度分别为9.8%vol和8.3%vol。混合发酵中的酒精度相较于非酿酒酵母得到明显提升，这与对糖的利用结果一致。将非酿酒酵母对酒品质的提升能力与酿酒酵母的高效发酵结合起来，有利于酿造出高酒精度的高品质果酒。

发酵液的酸碱度是影响酵母发酵活力的重要因素之一，发酵液的pH值变化对酵母活动有一定的影响。由图2可知，不同菌种发酵体系中pH值的变化趋势相同，但分解酸的能力不同。由于乙醛脱氢酶的转录在酿酒酵母中高表达、在德尔布有孢圆酵母中低表达，且乙酰辅酶a合成酶与乙酰辅酶a水解酶的转录在德尔布有孢圆酵母中高表达、在酿酒酵母中低表达，因而德尔布有孢圆酵母分解乙酸的能力高于酿酒酵母[15]，导致德尔布有孢圆酵母的发酵液pH值高于酿酒酵母。由图2可知，混合发酵液pH值比单菌酿酒酵母发酵液高，说明混合发酵可以在生物维度上调节果酒酸度，对果酒风味的形成有积极的影响。

2.2 不同发酵体系中香味物质比较

不同发酵体系中主要香气成分见表1。

表1 不同发酵体系中主要香气成分Table 1 Aroma compounds identified in pitaya wines from different fermentations

由表1可得，8种不同发酵体系酒样中共检测出24种主要香气成分，其中酯类物质9种，酸类物质8种，醇类物质6种，酮类物质1种。

乙酸被认为是影响果酒风味的重要影响因素之一，超过0.7 g/L时会散发出刺鼻的酸味，给果酒带来不良口感[16-17]。在单菌发酵中RB2和X16产生的酸类化合物较多，其中乙酸含量最高达到8.12 mg/L，在PRELUDE和NS-D的单菌发酵中乙酸含量明显降低，在混合发酵中乙酸含量均低于RB2与X16的发酵液，说明德尔布有孢圆酵母可以降低乙酸的产生[18-19]。苯乙醇可以赋予果酒良好的花香与果香味，乳酸乙酯和葵酸乙酯具有果香和奶油香气[20]，在PRELUDE和NSD的单菌发酵液均检测到高浓度的苯乙醇、乳酸乙酯和葵酸乙酯，说明德尔布有孢圆酵母能够调节果酒香气[21]。异戊醇是在火龙果酒中产生的较多的高级醇[22]，可以提供酒香，增加火龙果酒香气的复杂度。

在混合发酵体系中，酯类物质种类与含量较酿酒酵母单菌发酵明显增加，在CF1中乳酸乙酯、琥珀酸乙酯与月桂酸乙酯含量升高，在CF3中葵酸乙酯含量增加，酯类化合物具有良好的香味，有助于提高火龙果酒的感官特性。3-甲基-1-戊醇因其具有蘑菇和土壤的特殊气味常被用于调味剂和芳香剂，在有PRELUDE和NS-D参与的酒样中均检测到相当含量的3-甲基-1-戊醇，表明德尔布有孢圆酵母具有很好地调节果酒香气的潜力[23-24]。

2.3 火龙果酒风味成分主成分分析（principal component analysis，PCA）

主成分特征值及其贡献率见表2。

表2 主成分特征值及其贡献率Table 2 Eigenvalues of principal components and their contribution to total variance

由表2可知，第一主成分贡献率为71.388%，第二主成分贡献率为10.468%，2个成分累计贡献率超过80%，因此2个主成分可以有效解释变量信息。

不同发酵体系中风味物质主成分分析图见图3。

图3 不同发酵体系中风味物质主成分分析图Fig.3 Principal component analysis score and loading plots of the aroma compounds produced from different fermentations

由图3a可知，1，3-丁二醇、乳酸、棕榈酸乙酯等与PC1呈显著正相关，琥珀酸乙酯、月桂酸乙酯等与PC1呈显著负相关。PC2与3-甲基-1-戊醇、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯等呈显著正相关，与乙酸乙酯、苯乙醇、乙酸等呈显著负相关。

由图3b可知，8种发酵火龙果酒分别位于不同的4个象限，可以反映出8种发酵体系的火龙果酒的风味具有较大的差异。RB2与X16在PCA1上得分较高，说明1，3-丁二醇、乳酸、棕榈酸乙酯在RB2与X16中含量较高，PRELUDE与CF1在PCA2上得分较高，说明3-甲基-1-戊醇、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯在其中含量较高。PRELUDE与CF1得分接近，两者风味接近，NSD与CF4得分接近，说明NS-D对CF4的风味形成有调整作用，RB2与CF3得分接近，X16与CF2得分接近，说明其风味相近。PRELUDE与NS-D位于PC1的负极，RB2与X16位于PC1的正极，而混合发酵主要集中在PC1的中间位置，说明混合发酵对果酒的风味物质有很大的调整作用[25-27]。

2.4 不同发酵体系中火龙果酒的感官评价

通过对不同发酵体系中火龙果酒的感官评价，得出火龙果酒的主要风味特征为果香、花香、甜香、生青味、发酵香、酸味、甜味、红色、醇香，并对各描述特征强度取平均值，如表3所示，并形成风味剖面图，见图4。

表3 不同火龙果酒的各项感官属性得分Table 3 Average scores of pitaya wines from sensory analyses

图4 不同发酵体系中火龙果酒的感官评价雷达图Fig.4 Radar plots depicting the favor profles of pitaya wines produced by different fermentation

就香气属性而言，花香、果香、醇香是火龙果酒的主要香气特征，在果香和花香上PRELUD、NS-D与CF1得分较高，RB2与X16得分较低。RB2、X16与CF1醇香浓烈丰满，CF3与CF4醇香寡淡单薄。生青味对火龙果酒香气贡献较小，发酵香在各火龙果酒中差异不大。就味道属性而言，由于PRELUDE与NS-D对糖分利用不足且产酸低，造成它们在口味上偏甜，且酸味不足，酒体单薄，口感单调，在混合发酵CF1～CF4中，酒体圆润、丰满，酸甜适中，爽口。就色泽属性而言，除CF4外，其他7种火龙果酒色泽红艳，红色调突出，外观良好。综上所述，CF1混合发酵火龙果酒香气馥郁协调，酒体醇厚圆润，口感酸爽，色泽红艳，属于高品质火龙果酒。

3 结论

本试验对两种非酿酒酵母与酿酒酵母的单菌发酵及混合发酵的发酵特性与风味进行了分析。发现非酿酒酵母PRELUDE与NS-D虽对糖源利用不足，酒精发酵能力低，但结合酿酒酵母RB2与X16后酒精度可接近酿酒酵母。PRELUDE与NS-D都有很好地降低乙酸的能力，产苯乙醇、乳酸乙酯和葵酸乙酯的能力高，且可以产出具有异域风味的3-甲基-1-戊醇，混合发酵可以在生物维度上调节火龙果酒的酸度，同时提高酒体中酯类物质的种类与含量，能够赋予火龙果酒良好的风味特征与香气属性。在感官评价中混合发酵CF1花香和果香浓郁，酸甜爽口，颜色红艳明亮，表现出更佳的感官品质。以上结果说明德尔布有孢圆酵母PRELUDE与RB2混合发酵有利于酿造出香气丰富、口感醇厚的高品质火龙果酒。