准噶尔山楂果实内生真菌的分离、鉴定及抗菌代谢物质研究

吴昊，刘伟，刘琳玉，任艳利

（伊犁师范大学生物与地理科学学院，新疆伊宁835000）

植物内生菌是指一种在植物部分或全部生活史中存活于健康植物各种组织的内部或细胞的间隙，但却不能使宿主植物产生病理特征的微生物[1]。研究表明内生菌在植物体内广泛存在且能通过与宿主植物的相互作用产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物[2]。代谢产物具有促进植物生长、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性[3-4]。槲皮素和山奈酚均是黄酮类化合物的典型代表，这两个化合物均有一定的抑菌效果。滕楠[5]验证了槲皮素对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等均有较强的抑制效果。徐海瑛等[6]利用从鱼腥草中提取出的槲皮素与槲皮素金属配合物对比研究抑菌效果，结果表明，槲皮素单体和槲皮素-Zn的抗菌活性均较强。金黄色葡萄球菌能够形成被膜从而抵御某些不利因素的干扰，明迪[7]发现山奈酚能从多种途径抑制金黄色葡萄球菌被膜的形成，从而间接起到抑菌作用。柏晓辉等[8]采用组织块法从黄精根部分离出的内生菌及其发酵液对绿脓杆菌和苏云金芽孢杆菌均有较强的抑菌效果。杨梦莉等[9]从灯盏花的根、茎、叶和花中分离出7株产黄酮的内生真菌，根部的内生真菌产黄酮的浓度达到2.625 mg/L。邓振山等[10]从酸枣的茎分离出了可以产生黄酮的内生真菌，并有很强的抑菌活性。张婷等[11]从油茶中分离出2株具有产黄酮能力的内生真菌，并测得发酵液中的黄酮含量分别为0.011 3 mg/mL和0.013 5 mg/mL。

目前尚未有关准噶尔山楂果实内生真菌的分离鉴定的报道，本研究对准噶尔山楂果实中内生真菌进行分离和鉴定，检测它们的抑菌活性，筛选出有抑菌活性的菌株，并对它们的发酵液进行分析检测，分析抑菌效果，以期为准噶尔山楂果实的综合利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

准噶尔山楂：于2017年10月在霍城县大西沟乡采集供试材料，经伊犁师范大学焦子伟教授鉴定为蔷薇科准噶尔山楂的果实，洗净后于4℃冰箱保存。槲皮素标准品、山奈酚标准品：上海源叶生物科技有限公司；dNTPs、PCR缓冲液、快速DNA提取试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；通用引物ITS1、ITS4：上海生工生物工程有限公司；乙腈（色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其余试剂均为分析纯。

大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）：伊犁师范大学微生物实验室提供。

ACQUITY UPLC H-Class高效液相色谱仪[配备光电二极管矩阵检测器]：沃特世科技（上海）有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：瑞士步奇公司；TGL-18M高速冷冻离心机：美国米尔洛克公司；T-100PCR仪：美国伯乐公司。

1.2 准噶尔山楂果实内生真菌的分离、纯化和保存

将采集的准噶尔山楂果实表面洗净，晾干水分。无菌水冲洗3次，用75%乙醇漂洗（20 s～30 s）后无菌水冲洗3次，8%次氯酸钠溶液浸泡5 min后无菌水冲洗4次，用无菌滤纸片吸干表面上的水分，切成5 mm×5 mm×1 mm大小的组织块接种于马铃薯葡萄糖琼脂（potapo dextrose agar，PDA）固体培养基上，25℃恒温培养5 d～10 d[12]。每日观察材料，待组织块边缘有菌丝长出，采用尖端菌丝挑取法把真菌转移到新的培养基上继续培养，经过2次～3次纯化，得到纯化菌株，对已纯化的菌株编号，转至冻存管PDA培养基上，于25℃培养箱中培养5 d～7 d，然后放入-20℃的冰箱内保存。

1.3 方法

1.3.1 试验菌种的活化和菌悬液制备

从冰箱中取出培养3代的内生真菌，置于无菌操作台上，使用5 mm的打孔器挑取菌饼接种到PDA平板中央，置于25℃的培养箱中恒温培养5 d～7 d后备用。

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活化及菌悬液的配制：用接种环各挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的单菌落接种于灭菌的LB斜面培养基上，37℃恒温培养24 h。用接种环挑取适量已活化的细菌，分别接入含有LB液体培养基的无菌锥形瓶（50 mL）中，37℃摇床振荡培养12 h，即得金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌悬液。

1.3.2 抑菌试验

琼脂块法：取已配制好的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌悬液150 μL，用三角玻璃棒涂布均匀（9 mm培养皿）。在每个LB固体培养基上用5 mm打孔器打均匀分布的3个孔，然后用直径为5 mm的打孔器取果实内生真菌菌饼，放入LB固体培养基中。将其放入37℃培养箱，倒置，恒温培养12 h，以十字交叉法测量菌落直径。

滤纸片法：在每个涂布细菌菌液的培养皿中均匀放置3个滤纸片。同时，蒸馏水作为阴性对照组，常用的氨苄青霉素滤纸作为阳性对照。37℃恒温培养箱中培养12 h后，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，计算其平均值[13]。

1.3.3 抑菌活性物质的检测

取1.3.2检测出的有抑菌活性的内生真菌，用直径5 mm的打孔器，沿菌落边缘打菌饼，取3颗～4颗菌饼放入100 mL PDA液体培养基中，在25℃、180 r/min的恒温摇床上振荡培养7 d～10 d，即为种子发酵液。每100 mL PDA液体培养基中加入1 mL种子发酵液，在25℃、180 r/min的恒温摇床上振荡培养，直到发酵液颜色变得澄清，菌丝球大小、密度稳定。在抽滤瓶中放一层脱脂棉，两层滤纸，对发酵液进行抽滤。然后，将抽滤好的发酵液在10 000 r/min的条件下离心10 min，除去菌丝和孢子[14-16]。用旋转蒸发仪浓缩至干，用甲醇溶解后再经过0.22 μm的滤膜过滤，制成供试样品。

1.3.3.1 薄层色谱分析

取适量槲皮素和山奈酚标准品溶于甲醇制成标准品溶液。吸取适量样品溶液、标准品溶液，在同一薄层板上点样。以氯仿与甲醇（6∶1，体积比）为展开剂，上行展开10 cm，晾干，喷3%三氯化铝-乙醇溶液，紫外灯下检测（254 nm），比较样品斑点的位置和标准品斑点的位置，进而初步筛选出能产槲皮素和山奈酚的内生真菌[17]。

1.3.3.2 高效液相色谱分析

色谱条件：C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），以水+0.1%甲酸（A）-甲醇（B）为流动相，梯度洗脱（0～7 min，35%～52%B；7 min～8 min，52%～100%B；8 min～9 min，100%～35%B），进样量 1.0 μL，检测波长 360 nm，柱温为30℃，流速0.3 mL/min[18]。准确称取干燥的槲皮素和山奈酚标准品，用甲醇配成 1、2、3、4、5、6 mg/L 浓度梯度的标准品溶液。分别准确吸取1.3.3中处理好的样品溶液和配制好的标准品溶液各1.0 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。以标准品浓度（mg/L）为横坐标，以峰面积为纵坐标求回归方程，根据回归方程计算发酵液中槲皮素和山奈酚浓度。

1.4 产黄酮内生真菌的鉴定

1.4.1 形态学鉴定

采用点植培养法[19-20]进行鉴定。用接种环挑取少量菌丝点植在平板中央，于25℃恒温培养箱中培养7 d～10 d。观察菌落形状、颜色、大小、培养基颜色、菌落边缘形状等。在25℃条件下，采用插片培养法进行菌种培养，待菌丝铺展开，长过插片的位置后，在光学显微镜下观察记录菌丝和孢子的形态特征。依据真菌的形态学分类法，初步确定产黄酮菌株的种属地位。

1.4.2 分子生物学鉴定

采用十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法[21]提取真菌基因组 DNA，用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCGGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）5.8S rDNA-ITS进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增[22]。采用 50 μL 反应体系：引物各2 μL，模板 1 μL，Taq 酶 1 μL，加双蒸水至 50 μL。反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸 2 min，30个循环；72℃延伸 8 min，1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收目标片段，送至上海生工生物工程公司测序。通过NCBI数据库的Blast程序在线比对分析，利用MEGA7.0软件进行聚类分析，通过Neighbor-Joining法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 具有抑菌效果的内生真菌的分离和筛选

2.1.1 抑菌试验

从准噶尔山楂的果实中通过真菌分离培养共分离得到14株内生真菌。按照SZ-A、SZ-B、SZ-C等英文字母顺序进行命名，结果发现内生真菌SZ-C及其发酵液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑制作用。

SZ-C及其发酵液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果见图1。

图1 内生真菌SZ-C及其发酵液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of endophytic fungi SZ-C and itsfermentation broth on Staphylococcus aureus and Escherichia coli

结果表明，培养12 h后，准噶尔山楂果实内生真菌SZ-C对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在29 mm～39 mm之间，平均值34 mm（图1A），对大肠杆菌也有明显的抑菌活性，抑菌圈直径在19 mm～20 mm之间，平均值19.3 mm（图1B）。

通过滤纸片法对得到的内生真菌的抑菌活性进行筛选。结果表明，培养12 h后，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在19 mm～21 mm之间，平均值20.3 mm（图1C），对大肠杆菌也有明显的抑菌活性，抑菌圈直径在19 mm～21 mm之间，平均值19.7 mm（图1D）。

2.1.2 抑菌活性产物的检测

采用薄层色谱法检测内生真菌SZ-C的发酵液。在紫外灯下发现，供试品中出现了与槲皮素和山奈酚标准品颜色和比移值相同的荧光斑点，初步确定该菌株可能产槲皮素和山奈酚。

槲皮素、山奈酚标准品和SZ-C发酵液的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析见图2。

图2 槲皮素、山奈酚标准品和SZ-C发酵液的HPLC分析Fig.2 HPLC analysis of standard quercetin and phenol and fermentation liquor of SZ-C

高效液相色谱检测显示，槲皮素和山奈酚标准品分别在4.29 min和6.11 min出现峰值。内生真菌SZ-C的发酵液与标准品在相同的时间出现了相同的吸收峰。结合薄层色谱法的结果，确定内生真菌SZ-C的发酵液中含有槲皮素和山奈酚。

用移液器吸取不同浓度的标准品1 μL注入液相色谱仪，测定其峰面积。以浓度（mg/L）为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到槲皮素的回归方程为y=11 777x+10 480，R2=0.998 1；山奈酚的回归方程为y=11 920x+9 813.3，R2=0.999 3。根据发酵液提取物的峰面积，由所得的回归方程计算出发酵液中槲皮素和山奈酚的含量为1.253 mg/L和1.329 mg/L。

2.2 内生真菌的鉴定

2.2.1 形态学鉴定

产槲皮素和山奈酚内生真菌（SZ-C）的形态特征见图3。

图3 产槲皮素和山奈酚内生真菌（SZ-C）的形态特征Fig.3 Morphology characteristics of quercetin and phenol endophytic fungi SZ-C

由图3可知，菌丝生长较慢，生长初期为白色，后颜色逐渐变深，变为深绿色，菌落变厚，SZ-C向外围颜色依次变浅，边缘有明显白色绒毛状。基质由浅黄色逐渐加深，变为深褐色。在显微镜下可以观察到菌丝贴培养基生长，暗绿色，呈树枝状，分支，分生孢子梗长，呈暗绿色，孢子形状不一（短棒状、椭球状、球状、卵圆状）。

2.2.2 分子生物学鉴定

内生真菌SZ-C 5.8S rDNA-ITS序列扩增片段的凝胶电泳分析见图4。

图4 内生真菌SZ-C 5.8S rDNA-ITS序列扩增片段的凝胶电泳分析Fig.4 Agqrose electrophoresis analysis of the amplified fragment of the endogenous fungi SZ-C 5.8S rDNA-ITS sequence

利用真菌PCR扩增通用引物ITS1、ITS4对内生真菌（SZ-C）基因组DNA进行序列扩增，分别得到相应的单一DNA条带，长度为540 bp，该片段包括ITS1、5.8S rDNA和ITS4的全部序列，以及18sDNA和28sDNA的部分序列。将测序序列提交至Gen Bank数据库，获得登陆号MH754635。利用Blast程序和Clustalx软件，与NCBI数据库中的已知菌序列进行同源性序列比较分析，选择与其同源性大于99.5%的菌种，利用MEGA7.0软件进行聚类分析，通过Neighbor-Joining法构建系统发育树，结果见图5。

图5 准噶尔山楂果实内生真菌SZ-C的5.8S rDNA-ITS序列系统进化发育树Fig.5 The phylogenetic tree of 5.8S RDNA-ITS sequence of endophytic fungus SZ-C from hawthorn fruit

结果表明，SZ-C与Alternaria tenuissima是同一个属，结合形态学特征分析，将SZ-C确定为极细链格孢菌。

3 结论与讨论

采用组织块法从准噶尔山楂果肉中成功分离出14株内生真菌，通过拮抗试验测定筛选出具有抑菌作用的内生真菌，结果表明，内生真菌SZ-C对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的拮抗效果最为显著，经过培养特征、形态学鉴定5.8S rDNA-ITS基因序列分析和遗传图谱分析，确定SZ-C为极细链孢格菌。

发酵液抑菌试验结果表明SZ-C的代谢产物具有较大的抑菌潜力，通过对发酵液的成分进行薄层层析和高效液相色谱分析得出发酵液中含有较高含量的槲皮素和山萘酚，其中槲皮素含量为1.253 mg/L，山萘酚含量为1.329 mg/L，结合文献推测发酵液的抑菌效果可能与这两个化合物有关，抑菌机制可能与破坏细菌细胞壁的完整性和细菌在培养基上的形态有关[23-24]；从对不同病原菌的抑制作用来看，不管是内生真菌本身还是内生真菌的发酵液，对金黄色葡萄球菌的抑制作用都较为显著，在后续的研究中希望能够以分离得到的高活性菌株的发酵产物为基础，测定槲皮素和山奈酚的含量与抑菌效果的关系，研发出相关植物源抑菌剂。

植物内生真菌资源丰富，其次生代谢产物种类繁多，是极具有开发应用前景的微生物资源。在本研究分离出的14株内生真菌中SZ-C的抑菌活性最为显著，其发酵代谢产物中存在的槲皮素和山奈酚具有一定的抗菌能力，可通过多种方法从发酵液中发现其他抑菌活性物质并进一步分离得到这些特殊的活性物质，并证明发挥抑菌作用的是哪一类化合物，是否是新的天然产物，这将再次证明植物内生菌的次级代谢产物具有广阔的应用前景。