食品中展青霉素的前处理及检测方法研究进展

邓健康，吴曈，扈婧，王青华，张迪，赵娟娟，吴荣荣*

（1.河北省湿地生态与保护重点实验室，河北衡水053000；2.衡水学院生命科学学院，河北衡水053000）

展青霉素（patulin，PAT）又名棒曲霉素，是一种由曲霉和青霉等真菌产生的次级代谢产物，同时也是一种神经毒素。目前发现约有60种微生物都能产生展青霉素，包括曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium），毛霉属（Mucor）、镰胞属（Fusarium）、丝衣霉属（Byssochlamys）[1]。展青霉素在生活中并不少见，广泛存在于各种霉变水果和青贮饲料中，主要污染水果及其制品，尤其是苹果、山楂、梨、番茄、苹果汁和山楂片等[2]。研究表明，在137个水果制品中，有30.7%的样品展青霉素浓度在10.0 g/kg～276.9 g/kg[3]。展青霉素对胃具有刺激作用。毒理学试验表明，展青霉素具有影响生育、致癌和致畸等毒理作用，严重可导致呼吸和泌尿等系统的损害，甚至导致神经麻痹、肺水肿、肾功能衰竭，对人体有很大的潜在危害[4]。许多国家和组织规定了食品中展青霉素的最大限量，GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中规定水果及其制品中展青霉素限量标准为50 μg/kg，国际组织尤其是欧盟等规定果汁类产品中展青霉毒素的最大含量低于50 μg/kg，儿童和婴儿食品中展青霉素的限量更低，不得高于 10 μg/kg[2，5]。

对展青霉素实现高灵敏、特异性和快速现场检测，是控制展青霉素污染的关键。食品中展青霉素的传统定量分析方法主要包括：高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、高效液相色谱串联质谱法（high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS）、薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC）、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 和毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）等。近几年已经有多篇综述回顾和总结了以上一种或几种检测方法的进展[2，6-9]。本文从样品前处理方法、分子印迹技术和适配体传感器等方面的最新进展进行总结，以期为展青霉素检测和质量控制提供参考和支撑。

1 前处理方法

传统检测方法中通常会遇到杂质干扰等问题，需要对样品进行前处理，从而获得更准确的定性和定量信息。前处理方法通常包括液液萃取、固相萃取和分散 固 相 萃 取（quick、easy、cheap、rugged、safe，QuECh-ERS），此外基于先进纳米材料的前处理方法也是研究的前沿。

1.1 液液萃取

液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）又称溶剂萃取，已经广泛用于食品中展青霉素的前处理。GB 5009.185—2016《食品安全国家标准食品中展青霉素的测定》中采用乙酸乙酯作为溶剂萃取展青霉素[10]。但是LLE耗费较多有机溶剂、成本较高。因此研究者正开发更多方法用于展青霉素的提取和分离。在分散液液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）方法中，萃取溶剂在分散溶剂的辅助下形成微小液滴，均匀分散在水样中，将展青霉素不断地萃取到有机相中，最后在水样和微量萃取剂之间达到平衡。乳浊液体系经离心后，收集沉淀中的展青霉素。该方法用于苹果汁和浓缩果汁样品中展青霉素的定量分析，具有低基质效应、操作方便、富集效率高和萃取剂使用量少的优点[11]。MAHAM等[12]提出了二元溶剂分散液-液微萃取法（binary solvents-based dispersive liquid-liquid microextraction，BS-DLLME）分离苹果汁中展青霉素。乙腈为分散溶剂、乙酸乙酯/氯仿为萃取溶剂，与DLLME相比，BS-DLLME提取效率更高。Li等[13]将单滴液-液-液微萃取（single-drop liquid-liquid-liquid microextraction，SDLLLME）-同位素稀释-超高效液相色谱-质谱联用（isotope dilution ultra performance liquid chromatography mass spectrometry，ID-LC-MS/MS）技术应用于苹果汁中展青霉素分析，大大降低了苹果汁中富糖基质的干扰，为高糖复合基质中痕量污染物的富集开辟了新的前景。尽管DLLME技术简便快速、成本低，但是仍然用到有毒有机试剂、需要蒸发过程等。盐析-旋涡辅助液-液微萃取（vortex-assisted liquid-liquid microextraction，VALLME）是在 DLLME 基础上的进一步发展，VALLME的一个重要特性是将萃取溶剂分散到水溶液样品中，通过涡旋获得乳浊液。无需分散溶剂，只需200μL己醇作为萃取溶剂，漩涡45s，即可提取5 mL样品中的展青霉素和糠醛[14]。

1.2 固相萃取

固相萃取（solid-phase extraction，SPE）是食品样品制备的最常用的工具之一。食品样品基质复杂、干扰物质多，展青霉素与5-羟甲基糠醛的光谱图接近，难以从光谱图上进行有效区分。因此研究者们常采用固相萃取或质谱技术提高方法的检测性能。Seo等[15]对比了 4 种固相萃取柱 HLB SPE、C18 SPE、Silica SPE、EASIMIPTM展青霉素分子印迹固相萃取柱去除杂质和抑制离子化效率波动的效果，结果发现HLB SPE效果最佳，ID-LC-MS/MS检测，展青霉素含量在3 μg/kg～40 μg/kg方法扩展不确定度约1%。随着痕量残留物提取和净化技术，以及高分辨率质谱等分析技术的不断进步，使得展青霉素高通量检测成为可能。Yang等[16]采用Oasis MAX 96孔板纯化离心果汁的上清液，超高效液相色谱-串联四极杆质谱（ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry，UPLC-MS/MS）检测，可以实现展青霉素的快速高通量检测，该方法可用于常规大量样品的检测工作。My-AflaPat多功能净化柱无需活化、上样、洗脱等步骤，样品加入净化柱后，提取液通过固定相进入套管中，即可实现提取液中的杂质与展青霉素的一步分离，操作快捷、方便[17]。毛细管开管柱内固相微萃取技术是一种新型的固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）技术。Zhang等[18]采用化学键合的方法将金纳米颗粒修饰至硅烷化石英毛细管内壁，再将适配体修饰在金纳米颗粒表面，将适配体修饰在毛细管柱内壁，该技术成功地将适配体的高特异性和高亲和力的优点与管内固相微萃取的快速高效的特点结合起来，实现了对展青霉素的高效分离。

磁性固相萃取是以磁性材料作为吸附剂的一种固相萃取技术，此技术已经广泛用于真菌毒素的分析。Wang等[19]采用溶剂热法制备了氧化石墨烯基磁性纳米复合材料（graphene oxide based magnetic nanomaterials，MGO），并对吸附剂 MGO 用量、洗脱时间、样品pH值、离子强度、洗脱溶剂和体积等进行了优化。在最优萃取条件下，对苹果汁中展青霉素进行萃取富集，HPLC法测定，该方法检出限为2.3 μg/kg，回收率为68.7%～83.6%。Yu等[20]以苯并呋喃-2-羧酸为载体的磁性纳米复合材料，用于苹果汁中展青霉素的预浓缩。传统固相萃取柱重复使用时存在交叉污染和吸附能力过限等问题，Yu等合成的磁性纳米复合材料可以多次重复使用，富集能力强。磁性纳米材料有望成为未来固相萃取的理想材料，目前用于固相萃取的磁性纳米材料仍面临回收率低、合成复杂等问题。

1.3 QuEChERS

基于QuEChERS方法的样品制备步骤包括乙腈溶液提取，加入氯化钠和硫酸镁使乙腈和水分层，取上清液加入硫酸镁、N-丙基乙二胺（primary-secondary amine，PSA）吸附剂和C18吸附剂进行分散固相萃取，去除色素、有机酸、金属离子等杂质干扰[21]。尽管QuEChERS有众多优点，但应用于含水量低的样品或色素和脂肪含量高的样品仍然存在复杂基质干扰等问题。为此近年来更多改进方法逐渐出现在视野中。例如将QuEChERS与SPE策略相结合，可有效去除样品基质干扰和浓缩展青霉素，以13C7展青霉素同位素内标，可以应用于多种实际样品中展青霉素的检测。对所测多种基质，该方法的重复性低于10%[22]。Sadok等[23]进一步改进QuEChERS，以1%乙酸酸化的乙腈为提取溶剂，加入硫酸镁、氯化钠和柠檬酸盐缓冲液，随后采用PSA吸附剂和石墨化碳为分散固相萃取剂。

2 基于分子印迹材料的展青霉素检测方法

传统的检测方法普遍需要大型精密仪器设备以及专业技术人员，限制了这些检测方法的广泛使用。因此发展简便、检测速度快、灵敏度高的检测方法变得至关重要。基于纳米材料的传感器可以实现上述要求，逐渐成为展青霉素分析的有力工具。分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）中特定的结合位点与靶标的特异性结合。这些结合位点的形状，大小以及特定官能团，赋予其识别靶标的特异性。与其它功能化材料相比，MIPs具有成本低，亲和力和特异性强，化学和物理特性高度稳定的优点。MIPs的这些突出优点使它们可以广泛用于各个领域，例如分离[24]、化学/生物传感[25]等。

2.1 分子印迹材料和色谱检测方法结合

Anene等[26]采用两步法制备了新型分子印迹聚合物。首先，将3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（γmethacryloxy propyl trimethoxyl silane，γ-MPTS）与四乙氧基硅烷（tetraethyl orthosilicate，TEOS）混合得到 SiO2-γ-MPTS。在SiO2-γ-MPTS基础上以展青霉素为模板，马来酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂，2，2’-偶氮二异丁腈作为前体，乙腈作为成孔剂，最终得到SiO2MA@MIP。采用新型MIP@SPE提取展青霉素，HPLC分析，检测限和定量限低至8.6 μg/L和28.6 μg/L。对于高色素含量的样品，分子印迹亲和柱能更好地去除色素干扰。除此之外有研究表明与SPE和QuEChERS相比，分子印迹固相萃取小柱能明显提高回收率[27]。但分子印迹材料合成过程中完全去除模板分子存在一定困难，易产生假阳性结果。通过设计假模板分子可以解决上述问题。Yang等[28]采用与展青霉素结构相似的2-吲哚酮作为假模板分子，表面印迹与溶胶凝胶法结合制备出一种对展青霉素具有特异性吸附的MIPs。将MIPs作为在线固相萃取吸附剂。在最优富集条件下，在线固相萃取柱对展青霉素的富集倍数为125倍。Zhang等[29]的研究以双模板合成MIPs，此MIPs作为SPE填料，可以有效吸附和浓缩展青霉素。Zhao等[30]在后续研究中，通过表面印迹技术制备了一种新型磁性分子印迹聚合物。分子印迹聚合物与磁性纳米粒子耦合后对展青霉素的吸附能力高于常规MIPs。在 Moreno-González等[31]的最新研究中，通过在线分子印迹固相萃取-毛细管区带电泳-质谱技术，实现了展青霉素检测仪器的小型化和自动化，并且可以有效避免5-羟甲基糠醛的干扰，为未来分子印迹材料与传统检测技术的结合提供了新的思路。

2.2 分子印迹荧光传感器

分子印迹荧光传感器结合了MIPs的高亲和力和高选择性以及荧光传感器的高灵敏度，成为分子印迹传感器领域的研究重点和热点之一[32]。量子点（quantum dots，QDs）是一种半导体荧光纳米材料。QDs的尺寸可调，荧光强度高，荧光稳定性好，使其得以应用在很多领域。非镉基量子点可以减少环境毒性，是目前的研究热点。锰掺杂ZnS量子点（Mn-ZnS QDs）是研究最多的量子点之一。Zhang等[33]合成了Mn：ZnS量子点表面包覆分子印迹材料应用于展青霉素检测。Mn-ZnS QDs表面印迹材料通过溶胶凝胶法制备而成，假模板分子（6-羟基烟酸）脱去后，形成识别空腔选择性识别展青霉素。展青霉素与印迹空腔结合导致Mn-ZnS QDs光强度降低，但该方法的灵敏度和抗干扰性能有待于提高。

上转换纳米材料（upconversion nanoparticles，UCNPs）作为新一代纳米荧光探针，UCNPs具有高度的光化学稳定性，尖锐的发射带宽和大的反斯托克斯位移（高达500 nm），这些优点使其适合用于制备复合荧光纳米探针。在过去几年中，人们对UCNPs在食品分析领域的应用进行了广泛探索。常洁[34]利用溶剂热法制得油溶性上转换纳米晶 β-NaYF4：Yb3+，Er3+，再用 TritonX-100和碱水解法对其进行水溶性改性和SiO2包覆，合成一种兼具支撑载体和信号输出功能的新型荧光载体UCNPs@SiO2，然后运用表面印迹技术制备出对痕量展青霉毒素具有高选择性的荧光分子印迹聚合材料UCNPs@MIPs。随着展青霉素浓度的增加UCNPs@MIPs的荧光淬灭程度不断增加。制备过程如图1所示。

图1 银纳米颗粒-金属有机框架材料-展青霉素-分子印迹聚合物的制备过程Fig.1 Schematic image for synthesis of MIP-capped AgNPs@ZnMOF

如图1所示，Bagheri等[35]合成了银纳米颗粒-金属有机框架材料（AgNPs@ZnMOF），以AgNPs@ZnMOF为载体，合成分子印迹聚合物（MIP-AgNPs@ZnMOF）。MIP-AgNPs@ZnMOF具有高过氧化物酶活性，催化过氧化氢-对苯二甲酸产生荧光产物。展青霉素通过氢键或与氨基发生亲电相互作用进入MIP位点，抑制MIP-AgNPs@ZnMOF的催化活性，从而实现定量分析。

2.3 分子印迹电化学传感器

分子印迹电化学传感器是基于分子印迹材料和电化学技术的具有特异识别能力的电化学传感器，具有高特异性、简便和高效的特点。构建理想的电化学传感器，需要修饰电极表面以获得更高的电活性。Guo等[36]利用分子印迹技术结合碳点、壳聚糖和金纳米粒子修饰玻碳电极表面，循环伏安法和差分脉冲伏安法监控电聚合过程。碳点、壳聚糖和金纳米粒子沉积在玻碳电极表面，电极表面积增加，电极导电率增大。此传感器的线性范围为 1×10-12mol/L～1×10-9mol/L，检出限为7.57×10-13mol/L。Huang等[37]提出了一种表面功能单体诱导策略构建展青霉素分子印迹电化学传感器。硫堇作为分子印迹聚合物的功能单体和信号指示剂，将铂纳米颗粒、氮掺杂石墨烯和硫堇的优良导电性与信号放大相结合，提高了灵敏度。此外，该传感器具有良好的稳定性、可重复性和选择性。

综上，多种分析技术与分子印迹材料结合，扩展了现有技术的应用范围，提高了灵敏度、特异性等。基于分子印迹材料的传感手段已经取得了许多成果，并且部分成果已经实现了产业转化和实际应用。但仍然存在以下问题：高通量检测是实现快速现场检测的重要因素，基于MIPs的高通量快速检测传感器的研究处于初步阶段；MIPs制备过程复杂，开发合成简便、高效的MIPs迫在眉睫；部分MIPs局限在非极性环境中，水相中有效吸附和识别展青霉素这一问题依然有待解决。

3 适配体传感器用于展青霉素检测

当今国际科研领域，适配体传感器（Aptasensor）的研究已成为最为活跃的前沿科学之一。核酸适配体（Aptamer）可以特异性结合目标分子如蛋白质、氨基酸、有机小分子和无机离子等[38]。适配体和真菌毒素等目标分子的结合具有很强的专一性和选择性。相对抗体来说，核酸适配体不依赖于动物或细胞，可以直接通过人工合成获得。适配体的稳定性和耐受性好，且其变性是可逆的，适合长期贮存和在常温下运输。适配体传感器具有特异性好、制备过程相对简单的特点，可以实现多种场合的现场快速检测[39-41]。因此，研究检测展青霉素的适配体传感器具有重要意义。然而，适配体传感器检测展青霉素存在一个障碍，那就是食品或环境中残存的展青霉素往往是微量，甚至是痕量的。一般情况下，样品前处理过程会对待测物造成损失或稀释，检测方法的最低检测限需低于限量标准1个数量级才能保证对待测物的准确检测。

Wu等[42]通过氧化石墨烯辅助的指数富集（systemic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）过程，筛选得到与展青霉素特异性结合的、高亲和力适配体。在候选适配体中，PAT-11序列与展青霉素结合，亲和力更高，选择性更好，解离常数（kd）为（21.83±5.02）nmol/L。氧化石墨烯（rGO-Fe3O4）吸附后导致羧基荧光素（carboxyfluorescein，FAM）荧光淬灭，在展青霉素存在时，适配体与靶标结合，使荧光恢复。DNase I不能水解rGO-Fe3O4上的适配体，但能够水解未吸附的适配体-展青霉素复合体，释放FAM和展青霉素，引发循环放大。rGO-Fe3O4吸附适配体后经磁分离，可以降低背景信号干扰，显著降低检测限[42]。

生物传感器的灵敏度通常依赖于目标分析物浓度与信号之间建立的关系。只有单一信号输出的荧光传感器，基于检测信号增高或检测信号降低，有可能出现假阳性或假阴性的检测结果。而具有两个检测信号的比率型传感器则可克服单一信号输出的不足。靶分子的存在会引起一种荧光基团信号增强，另一种荧光信号降低。该策略不仅可提高检测灵敏度，还可增强特异性[43]。比率型荧光探针可以消除探针自身的不稳定性，也可以削弱检测环境带来的误差。例如Ahmadi等[40]利用FAM和羧基四甲基罗丹明（carboxytetramethylrhodamine，TAMRA）标记的DNA构建了展青霉素比率传感器，FAM与TAMRA在490 nm激发下发生荧光共振能量转移（fuorescence resonance energy transfer，FRET）现象，不仅避免了环境信号干扰问题，而且提高了传感器的灵敏度。通过DNA序列的精准设计，进一步提高了适体传感器的灵敏度。在Zhang等[44]的最新研究中，聚集诱导发光分子、酶辅助链置换信号放大和磁分离技术结合，相比Ahmadi等[40]的研究，灵敏度更高，检测限达到0.042 ng/L。与商品化DNA标记染料相比，TTAPE稳定性更好，结合链置换信号放大和磁分离技术，使该传感器成功应用于苹果和葡萄汁中展青霉素的检测。Wu等[39]提出了一种新的基于FRET的展青霉素测定方法。稀土上转换发光材料（upconversion nanoparticles，UCNPs）作为荧光供体，金纳米颗粒（gold nanoparticles，AuNPs）作为荧光受体，适配体修饰在UCNPs表面，互补链pcDNA修饰在AuNPs表面，将二者孵育得到UCNPs-AuNPs复合结构，导致上转换发光的猝灭。展青霉素存在时适配体与pcDNA解离，荧光恢复，通过荧光信号的差异实现展青霉素的定量检测。采用核酸外切酶催化的靶循环策略，提高了FRET系统的灵敏度。分析过程仅需要50 min[45]。

电化学适配体传感器是通过将适配体直接或间接连接在导电衬底上而开发的传感器，电化学阻抗法，伏安法（循环伏安法、微分脉冲伏安法、方波伏安法、线性扫描伏安法）和场效应晶体管是最常见的检测手段。电化学适配体传感器具有选择性好、灵敏度高、分析速度快和成本低的特点，能在复杂体系中进行在线连续监测，广泛应用于化学、生命科学、食品和环境等领域[45]。在大多数情况下，首先对电极表面进行功能化，以使适量的适配体结合，并改善电子转移特性[46]。纳米材料和纳米复合材料已被用于增加电活性区域，增加适配体的负载量。展青霉素适配体传感器示意图如图2所示，将壳聚糖-氧化锌-纳米花修饰电极上，电沉积法将金纳米颗粒AuNPs修饰在纳米花表面，通过Au-S键连接互补单链DNA，适配体修饰的多孔金属有机框架@亚甲基蓝作为信号探针。由于氧化锌纳米花具有较大的比表面积，电极可以加载更多的信号探针和AuNPs来实现信号放大[46]。展青霉素与适配体结合释放互补单链DNA和信号探针，导致电信号降低。此传感器具有可重复性、可再生性、长期稳定性和特异性的优点[47]。Xu等[48]用黑磷纳米片（black phosphorus nanosheets，BPNS） 对玻碳电极 （glassy carbon electrode，GCE）进行修饰，静电吸附展青霉素适配体。展青霉素与适配体结合，阻碍电极表面的电子转移，为了提高传感器的性能，用金纳米颗粒对BPNSGCE进行了进一步的修饰，然后用巯基修饰适配体对其进行修饰。修饰后的电极用于展青霉素检测，具有更宽的线性范围（0.1 nmol/L～10.0 μmol/L）和更低的检测限（0.03 nmol/L）。

图2 展青霉素适配体传感器示意图Fig.2 Schematic representation based aptamer sensor for DAT detection

目前筛选得到的展青霉素适配体序列较少，在稳定性与亲和力等方面仍需加强研究。在检测食物样品中展青霉素时，检测体系中的基质会影响适配体特异性和标记染料的稳定性。通过简化的样品制备过程来降低基质效应，适配体与稳定易标记的纳米材料相融合，是展青霉素适配体传感器面临的挑战和今后发展的趋势。近年来分子印迹材料和适配体技术有力推动了展青霉素检测方法，常见检测方法如表1所示。

表1 近年基于分子印迹材料和适配体的展青霉素检测方法汇总Table 1 Summary of patulin detecting methods based on MIPs or aptamer in recent years

4 前景与展望

传统检测方法中通常会遇到杂质干扰等问题，需要对样品进行前处理，从而获得更准确的定性和定量信息。前处理方法通常包括液液萃取、固相萃取和QuEChERS，基于先进纳米材料的固相微萃取和磁性纳米材料可以减少有机溶剂使用量、简化处理过程，有望成为未来固相萃取的理想手段。展青霉素分子印迹技术的建议合成方法、低毒材料的合成，分离和传感的作用机理研究仍需不断探索。分子印迹材料在水相中的展青霉素识别存在一定困难，需要加强在水相中的应用。适配体传感器具有特异性好、制备过程相对简单的特点，可以实现多种场合的现场快速检测。但目前展青霉素适配体序列较少，在稳定性与亲和力等方面仍需加强研究。在检测食物样品中展青霉素时，检测体系中的基质会影响适配体特异性和标记染料的稳定性。通过简化的样品制备过程来降低基质效应，适配体与稳定易标记的纳米材料相融合，是展青霉素适配体传感器面临的挑战和今后发展的趋势。

当前，复杂食品基质中展青霉素的检测朝着准确、快速、环保和高通量的方向发展，相信随着纳米技术、适配体和DNA技术的发展，未来分子印迹材料和适配体将在展青霉素样品前处理和检测领域发挥更加积极的作用。