生物炭对盐碱胁迫下黑麦草和紫花苜蓿光合及抗氧化特征的影响

任怀新，王冬梅，王 慧，张泽洲，刘若莎，黄 薇，谢正丰

（北京林业大学水土保持学院，北京 100083）

0 引 言

世界上有100多个国家和地区存在盐碱化问题，约有9.55×108hm2的土地具有盐碱化趋势[1]。土壤盐化与碱化是两种不同的非生物胁迫，中国的盐碱地大多为盐化与碱化同时存在的混合盐碱地，比单一盐胁迫、碱胁迫具有更大的危害性[2]。紫花苜蓿（Medicago sativaL.）是世界上广泛种植的一种豆科牧草，产量高、营养价值丰富，其根系粗壮，根系上的根瘤具有固氮的能力，在土壤改良中具有广泛的应用[3]。禾本科植物黑麦草（Lolium perenneL.）是一种优良的具有观赏价值和使用价值的草坪草和牧草草种，其根系浅而密集，可有效改善土壤结构，常被用作生态修复植物[4]。近年来紫花苜蓿和黑麦草因其良好的经济和生态效益在盐碱地区得到广泛的种植，但土壤盐碱化严重威胁土地利用率，影响作物的生长发育[5-6]，降低作物的质量和产量[7]，甚至会导致作物死亡[8-9]，因此，如何改良盐碱地、提高作物产量已成为当前农业发展所面临的主要问题。

生物炭是农林废弃物在缺氧或无氧条件下经热裂解制成的稳定、高度芳香化的固体富碳产物[10-11]，研究发现，生物炭具有较大的比表面积及丰富的孔隙结构，可促进土壤团聚体形成[12-14]，减缓盐分胁迫[15-16]，改善土壤养分和结构状况[17-18]。生物炭可有效改善植物幼苗地下根系和地上茎叶形态，提高作物光合及养分吸收能力[19-20]，减轻盐碱胁迫所造成的非生物氧化胁迫[21]，提高作物产量[22]。目前有关生物炭对土壤性质以及植物生长生理的影响等方面研究较为广泛，而关于生物炭对混合盐碱胁迫下黑麦草和紫花苜蓿光合及抗氧化系统影响的研究有待深入。植物在逆境下会产生相应的应对机制，胁迫后第14 d是植物适应盐碱环境的关键时期，随着时间延长，植物会逐渐适应逆境[23]，有关黑麦草及紫花苜蓿在盐碱胁迫下通过长期试验，对不同生长期的生长状态及作物产量影响的研究较多，均表明添加生物炭可促进植物生长[13-14]，但关于植物在盐碱胁迫初期的响应机制研究较少，且缺少不同生物炭施用量影响的定量分析[24]。因此，本文采用盆栽试验的方法，设置3种生物炭添加量，以黑麦草和紫花苜蓿为供试植物，探究不同生物炭用量对盐碱胁迫初期黑麦草和紫花苜蓿生长指标、光合特性、丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响，提出适宜的生物炭添加量，以期为盐碱环境中科学应用生物炭，促进作物生长和增产提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所需土壤采自北京市昌平区农田（115°50′17″E，40°2′18″N），剥除表层植被后，取0～20 cm土层，带回实验室风干，过2 mm筛备用。试验土壤PH值为7.85，容重为1.1 g/cm3，有机质含量为20.15 mg/g，全氮含量为0.81 mg/g，全磷含量为0.53 mg/g。试验所用生物炭为500 ℃高温裂解的玉米秸秆生物炭。供试植物为多年生豆科植物紫花苜蓿及禾本科植物黑麦草，试验种子由北京正道生态科技有限公司提供。

1.2 试验设计

试验于2020年8－10月在北京林业大学苗圃进行。采用直径13 cm、深度10 cm的塑料花盆进行盆栽试验。试验共设置正常土壤（CK），盐碱胁迫处理（C0），盐碱胁迫+1%生物炭（C1），盐碱胁迫+3%生物炭（C2），盐碱胁迫+5%生物炭（C3）5个处理，每个处理设置3个重复。试验开始前，按比例称量土壤和生物炭，其中，C1为1 000 g土壤+10 g生物炭，C2为1 000 g土壤+30 g生物炭，C3为1000 g土壤+50 g生物炭，CK和C0分别添加1 000 g土壤，将生物炭和土壤充分混合后装入盆中。试验前40 d为预处理期，每盆播种紫花苜蓿、黑麦草种子20粒，播种后进行常规培育，试验开始前毎盆选取长势相近的10株植物进行定苗。本试验采用150 mmol/L的NaCl、Na2CO3、NaHCO3混合盐碱溶液进行盐碱胁迫，试验开始后，C0、C1、C2、C3处理一次性添加100 mL混合盐碱溶液，CK处理添加100 mL去离子水，试验共进行14 d。试验结束后，每盆选取5株植物测定叶片净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率及叶绿素含量；对10株植物进行破坏性取样，清洗并吸干水分后，测定植物生物量、株高及根长；取顶部倒数第二片叶进行植物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性、过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性及过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性测定。

1.3 测定指标与方法

利用直尺法测量黑麦草和紫花苜蓿株高和根长，称重法测定生物量，采用SPAD-502叶绿素速测仪测定植物叶绿素含量，采用LI－6400型便携式光合仪（美国LI－COR公司）测定植物净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度及蒸腾速率；采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量，采用试剂盒测定植物超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性和过氧化氢酶（CAT）活性，试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。

1.4 数据处理与分析

使用Excel 2016对数据进行统计整理。采用SPSS 24.0对数据进行多重比较（Multiple Comparisons: Least Significant Difference），单因素方差分析（One way ANOVA）和Spearman相关性分析，使用Origin 8.5进行绘图。

2 结果与分析

2.1 生物炭对盐碱胁迫下植物生长指标的影响

于试验第14天进行植物生长指标测定。由图1可知，盐碱胁迫显著降低黑麦草和紫花苜蓿的生物量（以10株计，下同），与CK相比分别降低了13.83%、26.53%，紫花苜蓿株高较CK显著降低25.54%，盐碱胁迫对黑麦草的株高、黑麦草和紫花苜蓿叶绿素含量及根长均无显著影响（P＞0.05）。施加生物炭后，植物生长水平显著提升，紫花苜蓿生物量和根长随生物炭添加量增加先增大后减小，C2处理的生物量和根长显著高于盐碱处理，高出比例分别为48.50%、48.09%（P＜0.05）；生物炭处理的黑麦草生物量较盐碱处理显著提升34.00%～82.34%，C2处理黑麦草生物量达到最高，为21.31 g；C2处理的黑麦草根长较盐碱处理高出17.15%，但与盐碱处理无显著差异（P＞0.05）。施加生物炭后盐碱胁迫下黑麦草的株高显著提高，且随生物炭添加量的增加先增大后减小，其中C2处理株高达36.70 cm，较盐碱处理显著高出31.19%；C2处理的紫花苜蓿株高较盐碱处理显著高出44.16%，其他处理无显著影响（P＞0.05），说明生物炭的缓解作用具有一定的阈值，施加量并非越大越好。施加生物炭显著提高黑麦草的叶绿素含量，C1、C2、C3处理的黑麦草叶绿素含量较盐碱处理显著高出5.82%、12.16%、32.46%；C1、C2、C3处理的紫花苜蓿叶绿素含量较盐碱处理分别提高0.12%、7.97%、6.64%，但与盐碱处理无显著差异（P＞0.05）。

2.2 生物炭对盐碱胁迫下植物光合特性的影响

于试验第14天进行植物光合指标测定。由图2可知，盐碱处理显著抑制黑麦草和紫花苜蓿的光合作用，与CK相比净光合速率分别降低54.00%、38.04%，气孔导度降低38.65%、80.27%，蒸腾速率降低35.90%、82.70%，胞间CO2浓度降低19.98%、25.02%。生物炭处理后，盐碱胁迫对黑麦草和紫花苜蓿光合作用的抑制得到有效缓解，黑麦草叶片净光合速率显著提高，且随生物炭添加量增加呈逐渐增大的趋势，与盐碱胁迫相比分别提升38.70%、85.00%和116.54%；紫花苜蓿叶片净光合速率随生物炭添加量增加呈先增大后减小的趋势，C2处理的净光合速率最高，较盐碱处理显著高出519.09%（P＜0.05）。生物炭对黑麦草和紫花苜蓿叶片气孔导度和蒸腾速率产生了积极的影响，随生物炭添加量增加均呈先增大后减小的趋势，C2的施用效果最优，气孔导度较盐碱处理分别提高118.69%、358.99%，蒸腾速率分别提高98.66%、526.53%（P＜0.05）。生物炭处理显著提高黑麦草叶片胞间CO2浓度，且C1处理显著高于C2、C3处理；紫花苜蓿叶片胞间CO2浓度随生物炭添加量增大而增大，其中C2和C3处理显著高于盐碱处理（P＜0.05）。

2.3 生物炭对盐碱胁迫下植物丙二醛含量和抗氧化酶活性的影响

于试验第14天进行植物丙二醛含量和抗氧化酶活性测定。由图3可知，黑麦草和紫花苜蓿对盐碱胁迫的抑制作用产生了积极的响应，与CK相比黑麦草和紫花苜蓿的MDA含量分别显著提高21.23%、6.07%，CAT活性显著提高10.50%、10.82%，SOD活性显著提高11.80%、12.93%，POD活性显著提高84.42%、20.09%（P＜0.05）。施加生物炭后，黑麦草和紫花苜蓿的渗透胁迫得到有效的缓解，MDA含量较盐碱处理显著降低，随生物炭添加量增大黑麦草MDA含量逐渐降低，而紫花苜蓿MDA含量呈先降低后增加的趋势（P＜0.05）。从图3可以看出，生物炭处理促进黑麦草和紫花苜蓿抗氧化酶系统对盐碱胁迫的响应，黑麦草CAT活性较盐碱胁迫显著提高9.66%～13.20%，各生物炭添加量处理无显著差异；C1处理的紫花苜蓿CAT活性显著高于盐碱处理，随着施炭量的增加，CAT活性逐渐降低。生物炭处理对盐碱胁迫下黑麦草SOD活性无显著影响；C1、C2、C3处理的紫花苜蓿SOD活性较盐碱处理提升29.13%～31.86%，且不同生物炭添加量处理间显著差异（P＜0.05）。C2、C3处理显著降低盐碱胁迫下黑麦草和紫花苜蓿的POD活性，C1处理无显著影响（P＞0.05）。

2.4 生物炭处理盐碱胁迫下植物生长生理指标相关性

生物量、株高以及根长之间存在极显著正相关关系（P＜0.01），且均与叶绿素存在极显著负相关关系（P＜0.01）。生物量、株高、根长与净光合速率和气孔导度存在显著正相关关系（P＜0.01），与胞间CO2浓度无显著相关性（P＞0.05），生物量与蒸腾速率存在极显著正相关关系（P＜0.01），株高与蒸腾速率存在显著正相关关系（P＜0.05），根长与蒸腾速率无显著相关性（P＞0.05），叶绿素与净光合速率、气孔导度、蒸腾速率以及胞间CO2浓度均无显著相关性（P＞0.05）。生物量与SOD活性存在显著负相关关系（P＜0.05），生物量、株高、根长与POD活性存在极显著负相关关系（P＜0.01），与CAT活性存在极显著正相关关系（P＜0.01），叶绿素与CAT活性存在极显著负相关关系（P＜0.01），与丙二醛含量存在显著负相关关系（P＜0.05）。气孔导度与净光合速率和蒸腾速率存在极显著正相关关系（P＜0.01），三者与胞间CO2浓度均无显著相关性（P＞0.05）。净光合速率与丙二醛含量存在极显著负相关关系（P＜0.01），净光合速率、蒸腾速率、气孔导度与POD活性存在极显著负相关关系（P＜0.01），与SOD活性和CAT活性无显著相关性（P＞0.05），胞间CO2浓度与CAT活性存在显著负相关性（P＜0.05）。丙二醛含量与SOD活性存在显著负相关关系（P＜0.05），与POD活性存在极显著负相关关系（P＜0.01），与CAT活性无显著相关性，SOD、POD、CAT三种酶活性间无显著相关性（P＞0.05）。

表1 生物炭处理盐碱胁迫下植物生长生理指标相关性分析Table 1 Correlation analysis of plant growth physiological indexes under saline-alkali stress treated by biochar

3 讨 论

3.1 生物炭对盐碱胁迫下植物生长指标的影响

植物的外部形态和生长状况是其受盐碱胁迫伤害程度的最直观表现。本研究中黑麦草和紫花苜蓿的生物量以及黑麦草的株高较CK显著降低，根长无明显变化，与大部分研究结果相似[25]。盐渍化土壤中含有过量的Na+，渗入细胞会造成原生质凝聚，破坏叶绿素[26]，使植物的生长减缓或停止，而本研究结果表明，盐碱胁迫对叶绿素含量无显著影响，可能是因为本研究盐碱处理时间仅14 d，短期盐碱胁迫并未达到胁迫叶绿素的标准，因此叶绿素变化并不明显。

添加生物炭后黑麦草和紫花苜蓿的生物量、株高显著增大，表明生物炭可部分缓解盐碱胁迫所导致的渗透压胁迫[27-28]，促进植物生长，这与孔祥清、谢迎新等[29-31]关于大豆、小麦以及西红柿等植物的研究结果一致，但Luo等[32]发现添加生物炭后对植物生长无效甚至产生负面影响，这可能与施入生物炭的种类以及添加量有关。本研究表明黑麦草和紫花苜蓿的生物量及株高并未随着生物炭添加量的增加而增加，3%生物碳添加量处理的生物量和株高显著高于1%和5%生物炭添加量处理，说明生物炭的缓解效应也存在一定的阈值。本研究中，生物炭处理对黑麦草根长无显著影响，而紫花苜蓿根长随生物炭施加量增加先增大后减小，且3%生物炭处理的根长显著高于盐碱胁迫，可能是因为紫花苜蓿的根系具有根瘤，在较短时间内即可与适宜添加量的生物炭相适应，改善紫花苜蓿的根际环境，从而增加土壤微生物的丰度和活性[33]，促进养分的吸收，进一步促进紫花苜蓿生长发育。

3.2 生物炭对盐碱胁迫下植物光合特性的影响

光合作用是植物制造自身生长所需有机物的主要途径，具有平衡大气中氧和二氧化碳的作用，在自然界中具有重要意义[34]。本研究中，黑麦草和紫花苜蓿的胞间CO2浓度及气孔导度均显著降低，这与鲁强等[26]关于秀丽四照花的研究结果相似，说明植株光合速率降低的主要原因是气孔限制；气孔导度与净光合速率和蒸腾速率存在极显著正相关关系（P＜0.01），气孔导度下降进一步引起黑麦草和紫花苜蓿净光合速率以及蒸腾速率的显著降低，与大部分研究结果一致[35-36]。

施入生物炭后，黑麦草的胞间CO2浓度随生物炭施用量增加先增大后减小，3%以及5%生物炭处理的紫花苜蓿胞间CO2浓度显著高于盐碱胁迫，此时黑麦草和紫花苜蓿的净光合速率均显著高于盐碱胁迫，说明施入生物炭后，盐碱胁迫对植物光合作用的抑制得到了有效的缓解，可能是因为添加生物炭能够改善植物根际环境，缓解盐碱胁迫对植物细胞造成的损害，提高植物净光合速率，这与大部分研究结果相似[37-39]。本研究结果表明，只有3%生物炭处理对紫花苜蓿气孔导度及蒸腾速率有显著影响，而各生物炭施用量处理的黑麦草气孔导度及蒸腾速率均显著高于盐碱处理，其中3%生物炭处理的气孔导度和蒸腾速率最高，造成这种差异可能是短期盐碱胁迫下，植物光合作用主要受气孔限制影响，且由其生长环境中的光照、温度以及水分等多种因素共同作用，而不同植物对逆境的适应与响应不同，因此对生物炭的响应也不同。本研究中，黑麦草的气孔导度、蒸腾速率和胞间CO2浓度，紫花苜蓿的气孔导度及蒸腾速率均随生物炭施用量的增加呈先增大后减小的趋势，表明生物炭的施用量并非越多越好，过量的生物炭可能会减小土壤有效孔隙量[40]，影响植物的代谢活动，反而会抑制植物的某些光合特性[41]，适宜的生物炭施用量才能提高植物光合作用，促进植物生长。

3.3 生物炭对盐碱胁迫下植物抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响

盐碱胁迫会导致植物体内渗透压升高，打破植物体内离子平衡，破坏细胞膜的结构和功能[42]。MDA是植物在逆境下膜脂过氧化的主要产物，其含量的高低可直接反应膜脂过氧化程度。本研究中，短期盐碱胁迫下黑麦草和紫花苜蓿的MDA含量显著高于CK，细胞膜结构遭到破坏，这与刘智微等[23]关于象草的研究结果一致。逆境条件下植物自身会产生相应的应对机制，在植物体内活性氧清除机制中，SOD、POD和CAT是最主要的抗氧化酶，三者通过协同作用清除体内的活性氧，维持体内自由基含量的稳态水平[43-44]，其活性变化可以反应逆境下植物体内的代谢和抗逆性变化。本研究结果显示，MDA含量与SOD活性呈显著负相关关系（P＜0.05），且盐碱胁迫下黑麦草和紫花苜蓿的SOD、POD和CAT活性均显著提高，说明盐碱胁迫下，黑麦草和紫花苜蓿短期内即作出积极反应，通过提高抗氧化酶活性，缓解盐碱胁迫对植物造成的影响，这与苏丹等[45]的研究结果一致。

添加生物炭后，紫花苜蓿SOD活性显著提高，但黑麦草的SOD活性无显著变化，可能是因为，短期内盐碱胁迫虽显著提升两种植物自由基的产生，但豆科植物具有根瘤，可与生物炭有效结合，生物炭的添加更有利于豆科植物对盐碱胁迫的缓解，提升其SOD活性以促进多余自由基的消除，而对禾本科的缓解作用不明显。紫花苜蓿中，SOD活性增强必然导致过氧化物H2O2大量生成，但本研究中用于消除H2O2的CAT和POD活性基本降呈降低趋势，植物的生长状况却显著优于盐碱胁迫，可能是因为有害自由基毒害对紫花苜蓿的影响强于过氧化物H2O2；而对于黑麦草，清除多余自由基的SOD活性无显著变化，但CAT活性显著提高，POD活性基本呈降低趋势，可能是因为CAT和POD具有互补的作用，而在盐碱胁迫初期，黑麦草清除H2O2以CAT的分解作用为主，周翠香等[46]关于生物炭对盐地碱蓬抗氧化酶活性影响的研究中也有相似结论。随生物炭添加量的增加，紫花苜蓿的SOD活性无显著变化，但POD和CAT活性显著降低，说明POD和CAT活性对生物炭的敏感程度较SOD更为强烈，且生物炭添加量越大，H2O2的消除越困难，但植物的生长没有出现受抑制的趋势，证明自由基对豆科植物的影响强于H2O2。随生物炭添加量增加，黑麦草的SOD和CAT活性均无显著变化，但POD活性下降明显，说明植物体内有机底物呈下降趋势，同时黑麦草光合速率呈现增长趋势，可能是因为短期内生物炭对盐碱胁迫下禾本科植物生长的缓解主要通过改善其组织结构而非有机物的累积。综上所述，黑麦草和紫花苜蓿幼苗对盐碱胁迫较为敏感，短期内盐碱胁迫即对其抗氧化系统产生影响，并抑制其生长及光合作用，而添加生物炭可提高二者抗胁迫能力，促进抗氧化酶系统作出积极响应，结合黑麦草及紫花苜蓿的生物量及光合性能均有所提升，认为适宜的生物炭添加量可有效缓解盐碱胁迫对黑麦草和紫花苜蓿生长的抑制，3%的生物炭添加量效果最好。研究表明生物炭可改善土壤环境[17-18]，而本研究只针对盐碱胁迫初期，黑麦草和紫花苜蓿幼苗为维持生长所做出的响应，关于盐碱胁迫下施加生物炭对植物生长和土壤环境变化的耦合研究，还需通过田间试验深入探究。

4 结 论

1）盐碱胁迫在初期显著影响黑麦草和紫花苜蓿的抗氧化酶活性，对细胞膜透性、光合速率和生物量积累具有不同程度的抑制作用，但对叶绿素含量和根长无显著影响（P＞0.05）。

2）盐碱胁迫初期，生物炭可有效提高黑麦草和紫花苜蓿的抗胁迫能力，缓解盐碱胁迫对其生长的抑制作用，3%生物炭处理的生物量、株高、根长较盐碱胁迫分别 增 加 了48.50%～82.34%、31.19%～44.16%、17.15%～48.09%，气孔导度、蒸腾速率增加了118.69%～358.99%、98.66%～526.53%，紫花苜蓿的叶绿素含量和净光合速率分别增加了7.97%和519.09%。

3）盐碱胁迫下，随生物炭添加量增大，植物生长指标、光合特性、细胞膜透性以及抗氧化酶活性基本呈现出低添加量促进、高添加量抑制的趋势，3%的生物炭施用量效果最好。