乳酸菌发酵改良枸杞酒风味工艺研究

陈彦辉，董建方，朱银龙，周学义，冯天霞，张建波，刘 乐

（宁夏红枸杞产业有限公司，宁夏中宁755100）

枸杞（Lycium barbarumL.）是一种多年生茄科灌木植物，其果实枸杞子长1～2 cm，呈鲜橙红色椭圆形[1-3]。作为一味传统的滋补中药，枸杞具有极高的药用、食用和经济价值。枸杞子中富含枸杞多糖、类胡萝卜素、多酚等活性成分，具有抗氧化、提高免疫力等优良的生物活性[4-5]。乳酸菌是一类利用碳水化合物发酵且主要产物为乳酸的革兰氏阳性菌的统称[6]。发酵过程中除了产生大量乳酸外，还伴随有酯类等风味物质的产生，可以充分提升产品风味、香气感官特征、抗氧化能力，在食品行业有广泛的应用[7-9]。发酵型枸杞酒是以枸杞为原料发酵而成的低度饮料酒，果香浓郁、口感馥郁，兼具较好的营养价值。大部分果酒的酿造工艺主要是在葡萄酒的酿造工艺基础上，根据自身原料的特性进行改良，枸杞酒也不例外。葡萄酒的发酵主要分为2个阶段，即前发酵和后发酵，前发酵主要是酒精发酵，糖分在酵母的作用下转化为酒精和二氧化碳，后发酵则主要是进行苹果酸-乳酸发酵，苹果酸在明珠串菌的作用下转化为乳酸[10-11]。通过苹-乳发酵可避免苹果酸带来的粗糙酸涩感，使口感变得柔软顺滑，同时可以提高酒体的生物稳定性以及增加酒体风味复杂性[12]。枸杞酒受限于原料本身特性，在酿造过程中不具备触发苹乳发酵的条件，这可能与枸杞发酵酒酒体略显单薄，酒体风味物质不够丰富存在一定的关联，从而影响消费者的饮用感官和枸杞酒的市场销量。

文献检索表明，目前针对枸杞酒风味物质提升的研究热点主要集中于酿酒酵母、非酿酒酵母的筛选，未见采用乳酸菌发酵提升枸杞酒体风味物质的报道。这主要是因为乳酸菌发酵过程中，产生大量风味物质的同时，伴随有大量乳酸的产生。如何在不破坏酒体风味的前提下中止乳酸发酵以及如何解决大量乳酸带来的酸感突出破坏酒体协调性的问题，是制约乳酸菌发酵应用于果酒酿造的主要因素。本工艺采用乳酸菌发酵，提升酒体风味物质含量，改良枸杞酒品质。采用陶瓷膜过滤分离出乳酸菌，中止乳酸发酵过程。分离出的乳酸菌截留液，经真空冷冻干燥、调配后制作为高附加值产品——益生菌粉。通过控制乳酸发酵程度、水稀释、甘油调配来平衡乳酸过量导致的酸感突出问题。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：枸杞鲜果，宁夏红枸杞产业有限公司石喇叭种植基地。

菌株：乳酸菌VEGE092，杜邦丹尼斯克（中国）有限公司；AC酵母，天津盛丰商贸有限公司。

试剂及耗材：D-异抗坏血酸钠，江西百勤异VC钠有限公司；低聚木糖，河南源隆生物科技有限公司；抗性糊精、硅酸钙，同发食化商贸有限公司；麦芽糊精，山东西王糖业有限公司；焦亚硫酸钾、明胶、膨润土、甘油，潍坊凯泽酿酒材料有限公司；果胶酶，湖南尤特尔生化有限公司；白砂糖，云南凤庆糖业集团有限公司；DPPH，沃瑞达斯实验试剂耗材；ABTS，酷尔化学科技（北京）有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒，南京建成生物工程研究所；硫酸亚铁、水杨酸、过硫酸钾、无水乙醇，均为分析纯，银川华厦化工有限责任公司。

仪器设备：DJ型双道打浆机，江苏汉隆机械制造有限公司；四连体发酵罐，武汉显海机械设备有限公司；PHS-3E pH（酸度）计，上海仪电科学仪器股份有限公司；LPS-125CH真空冷冻干燥机，无锡莱浦仪器设备有限公司；YB-800B多功能粉碎机，永康市速锋工贸有限公司；SJM-FHM陶瓷复合膜分离设备，合肥世杰膜工程有限责任公司；数显折光仪，广州市爱宕科学仪器有限公司；恒温培养箱，力辰仪器科技有限公司；洁净工作台，济南鑫贝生物技术有限公司；浊度计，上海昕瑞仪器仪表有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

本试验采用工艺流程如图1所示。

图1 工艺流程图

1.2.2 操作要点

原料处理：新鲜采摘或采摘后及时冷冻等方式保存完好的鲜枸杞，拣除霉烂果、叶柄以及石粒、铁块等杂物。喷淋清洗、榨汁后转入发酵罐，加入0.05%异抗坏血酸钠进行护色。执行巴氏杀菌工艺后，冷却。

乳酸菌接种：冷却至37℃，接种乳酸菌。

乳酸菌发酵：菌种接入后，控温37℃、密闭无氧发酵。监测发酵醪滴定酸变化，滴定酸达到5 g/L时（以乳酸计），停止发酵。

陶瓷膜过滤：依次使用0.2%NaOH溶液、0.2%柠檬酸溶液、沸水清洗0.5 μm、0.2 μm膜孔径规格陶瓷膜过滤设备。清洗完成后，进行过滤。透过液加入硫至体系中游离二氧化硫含量为40 mg/L后转入清洗好的发酵罐中备用。截留液进行真空冷冻干燥，100目粉碎，使用低聚木糖25%、抗性糊精10%、麦芽糊精20%、硅酸钙5%进行调配，调配完成后装瓶。

降酸：陶瓷膜过滤后期，反复加水稀释，对糖分进行洗脱，将透过液固形物含量降为5°Bx以下后，停止过滤。同时，稀释过程也是降酸的过程，滴定酸控制为2.5 g/L。

酶解：发酵罐中加入50 mg/L果胶酶、复合酶，50℃酶解2 h。

发酵：0.1 g/L用量接种AC酵母，控温15～18℃进行发酵。待比重降低至1050～1060 g/L时，按照酒精度12%vol计算，分次补充适量白砂糖。

调配：使用甘油对口感进行调整。

下胶：待发酵结束，加入硫至体系中游离二氧化硫含量为4 mg/L后，添加0.6 g/L膨润土，执行下胶工艺。

陈酿：下胶结束的发酵原酒转入储酒罐，-4℃冷处理15～20 d，使冷不稳定性成分析出，同时有利于酒体陈酿。

除菌过滤：使用膜孔径0.5 μm板框过滤机过滤，除去冷冻过程中析出的不稳定成分，膜孔径0.2 μm微滤膜过滤除去酵母、细菌。

灌装：除菌过滤后，进行无菌灌装。

1.2.3 降酸方式的选择

目前，果酒降酸的方式主要有化学降酸法、物理降酸法、生物降酸法、加水勾兑法[13-15]。化学降酸法对酒体口感、香气破坏较大，不适用于枸杞酒这种内含物较单薄的酒体。物理降酸法可以应用于工业化生产的主要有冷冻法、吸附法。冷冻法主要针对酒石酸盐含量丰富的酒体，吸附法会导致酒体香气损失[16]。目前，还未见生物降酸应用于果酒工业化生产的报道。综合考量，选择加水勾兑法，在原料陶瓷膜处理阶段降酸。在陶瓷膜过滤工段加水勾兑，一方面有利于枸杞汁中固形物的洗脱，另一方面可以充分混匀。

1.2.4 单因素实验

通过预实验，确定以降酸料液比、乳酸发酵时间、乳酸菌接种量为3个主要影响因素，以感官评价值为测试指标，确定发酵因素水平。

料液比：以20 DCU投料量发酵菌种加入发酵醪，37℃恒温发酵24 h后，陶瓷膜过滤工段，加入2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5 体积比的纯净水降酸后进行发酵，测定酒体滴定酸与感官评价值。

发酵时间：以20 DCU投料量发酵菌种加入发酵醪，37 ℃恒温发酵6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h，陶瓷膜过滤工段1∶1加水勾兑后进行发酵，测定酒体可滴定酸与感官评价值。

菌种接种量：以 10 DCU、20 DCU、30 DCU、40 DCU、50 DCU、60 DCU投料量发酵菌种加入发酵醪，37℃恒温发酵24 h后，陶瓷膜过滤工段1∶1加水勾兑后进行发酵，测定滴定酸与感官评价值。

1.2.5 正交试验

以降酸料液比、乳酸发酵时间、乳酸菌接种量为影响因素，采用正交试验优化乳酸发酵枸杞汁的工艺，以感官评分值为指标，确定最佳发酵条件、因素、水平设置见表1。

表1 发酵工艺的试验因素水平表

1.2.6 感官评定

请公司研发、质检、生产部门无饮食偏好的人员共7人组成品评小组，按照表2对酒体的色泽、澄清度、香气、口感进行综合评定，去掉最高分、最低分后，取平均值作为评分结果。

表2 发酵酒的感官评定表

1.2.7 下胶实验

以浊度值作为指标，采用膨润土(A)单一使用以及膨润土(A)与明胶(B)复配进行下胶、0.45 μm膜孔径板框过滤，并对处理后的酒体进行澄清效果评价、感官评分。

1.2.8 理化指标分析

按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[17]分别测定宁夏红12%vol金色传杞酒（A）、乳酸菌发酵改良枸杞果酒(B)理化指标，并做对比分析。

1.2.9 微生物实验

按照GB 4789.1—2016《食品微生物学检验总则》[18]、GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》[19]、GB 4789.15—2016《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》[20]分别测定宁夏红12%vol金色传杞酒（A）、乳酸菌发酵改良枸杞果酒（B）菌落总数、霉菌和酵母数，并做对比分析。按照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》[21]测定益生菌枸杞粉（C）中乳酸菌数。

1.2.10 稳定性实验

1.2.10.1 蛋白稳定性（热稳定性实验）

取25 mL比色管加入25 mL酒样，80℃水浴加热30 min，24 h后进行观察,若酒体澄清透明、无沉淀，则酒体蛋白稳定性合格。

1.2.10.2 氧化稳定性

取50 mL三角瓶装入50 mL酒样，加入0.2 mL 15%双氧水，常温观察48 h，若酒体澄清透明、无沉淀，则酒体氧化稳定性合格。

1.2.10.3 微生物稳定性

离心管中装入酒样，在4000 r/min下离心15 min，若底部无沉淀，则微生物稳定性合格。

1.2.10.4 冷稳定性

酒体在-4℃下观察7 d，不出现沉淀，则酒体冷稳定性合格。

1.2.10.5 铜稳定性

取25 mL比色管加入25 mL酒样，加入0.1 mL的10%亚硫酸，常温条件下放置一周后观察，若酒体澄清透明、无沉淀，则酒体铜稳定性合格。

1.2.11 抗氧化分析

DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力的测定参照兰永丽[22]的报道进行，ABTS自由基清除能力的测定参照何瑞[23]的报道进行，总抗氧化能力（FRAP法）的测定采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，按照试剂盒的说明进行操作，分别测定乳酸菌发酵改良枸杞酒、宁夏红12%vol金色传杞酒DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、总抗氧化能力，并做对比分析。

1.3 数据处理

试验采用 Excel、SPSS 23.0、Graphpad Prism 7对数据进行统计、处理。

2 结果与分析

2.1 发酵酒发酵实验

2.1.1 单因素实验结果

降酸料液比、乳酸菌发酵时间、乳酸菌接种量的单因素实验结果见图2、图3、图4，各因素对感官评分值均有显著性影响（p＜0.05）。料液比为1∶1、乳酸菌发酵时间为24 h、乳酸菌接种量在20 DCU时为最佳发酵条件。

图2 料液比对发酵酒感官品质的影响

图3 发酵时间对发酵酒感官品质的影响

图4 乳酸菌接种量对发酵酒感官品质的影响

2.1.2 正交实验优化结果

以发酵酒的感官评分为指标，确定了影响发酵酒感官品质的因素顺序为：发酵时间＞料液比＞乳酸菌接种量，最佳发酵条件为A2B2C1，即发酵酒的工艺条件为料液比1∶1，发酵时间24 h，乳酸菌接种量为20 DCU（表3），该条件下感官评分值为81分。

表3 发酵酒发酵工艺的正交试验结果

对正交试验所得工艺条件进行验证性发酵，所得发酵酒感官评分为83分，与正交试验结果相一致。

对感官评分进行方差分析（表4）可知，料液比、发酵时间、接种量均对感官评分有显著性影响（P＜0.05）。

表4 感官评分方差分析

2.2 发酵酒酿造过程中基础理化指标测定结果

如图5、图6、图7表示，发酵酒酿造过程中基础理化指标的变化，发酵过程中的pH值和总酸含量对酒体的口感、风味以及产品的货架期均有较重要的影响。pH值在发酵过程中逐步降低，第11天降至最低，为3.94，然后逐渐上升直到发酵结束。与此同时，总酸在发酵0～8 d过程中逐渐增加，9～13 d逐渐减少，在最后2 d的发酵过程中有略微上升直到最终。总酸含量的增加主要是由于发酵过程中酵母产酸所致。发酵过程中，酵母不断消耗糖分以及外源补糖，在发酵过程中总糖总体呈下降趋势，至残糖含量为4 g/L，不再发生变化。同时产生大量酒精，酒精度逐步上升（从0%vol到12.5%vol）。

图5 发酵酒酿造过程中酒精度变化

图6 发酵酒酿造过程中总酸、pH值变化

图7 发酵酒酿造过程中总糖含量变化

2.3 下胶实验

实验结果见表5。根据下胶实验结果，0.6 g/L膨润土用作澄清剂，澄清效果最佳且用量最少，避免过量吸附对酒体的破坏。

表5 发酵酒下胶实验结果

2.4 理化指标分析

对宁夏红12%vol金色传杞酒(A)、乳酸菌发酵枸杞酒理化指标(B)各项理化指标进行测定，测定结果见表6。乳酸菌发酵枸杞果酒滴定酸含量明显高于宁夏红12%vol金色传杞。乳酸菌发酵枸杞果酒的干浸出物、色度指标要低于宁夏红12%vol金色传杞，可能与多次执行过滤工艺，导致部分物质的损失及水稀释比例过高有关。

表6 理化指标对比分析

2.5 微生物检验分析

对宁夏红12%vol金色传杞酒(A)、乳酸菌发酵枸杞酒(B)、益生菌粉(C)各项微生物指标进行测定，测定结果见表7。两款酒体的菌落总数、霉菌酵母菌数均低于80 CFU/750 mL，符合标准要求。益生菌粉中乳酸菌活菌数达3.1×107CFU/g,具备一定的保健功效。

表7 微生物指标对比分析

2.6 稳定性分析

对宁夏红12%vol金色传杞酒、乳酸菌发酵枸杞酒进行蛋白、氧化、微生物、冷、铜稳定性指标检测，经处理后，2种酒体观察过程中呈现澄清、透明，均未出现沉淀，酒体稳定性良好。

2.7 抗氧化性分析（图8、图9）

图8 抗氧化能力对比分析

图9 总抗氧化能力对比分析

经乳酸菌发酵所得酒体DPPH自由基清除率与现有产品无显著性差异，ABTS自由基清除率、羟自由基清除率、总抗氧化能力均显著高于现有产品。抗氧化性能的测定结果与Kadyan[24]、Laaksonen等[25]的报道一致，乳酸菌发酵可以提升酒体的抗氧化性能。

3 结论

本实验通过单因素实验、正交实验，确定乳酸发酵改良枸杞酒风味的最佳工艺参数为：降酸料液比1∶1、乳酸发酵时间24 h、乳酸菌接种量20 DCU，各因素对发酵酒感官影响的主次顺序为：发酵时间＞料液比＞乳酸菌接种量。通过下胶实验，确定最佳下胶方案为膨润土0.6 g/L使用量下胶。发酵所得酒体滴定酸含量显著高于现有产品，酸感更突出。干浸出物、色度指标低于现有产品，可能与多次执行过滤工艺及水稀释比例过高有关。2款酒体菌落总数、霉菌酵母菌数检测指标均低于80 CFU/750 mL，符合标准要求。益生菌粉中乳酸菌活菌数达3.1×107CFU/g，具备一定的保健功效。抗氧化实验中，经乳酸菌发酵所得酒体DPPH自由基清除率与现有产品无显著性差异，ABTS自由基清除率、羟自由基清除率、总抗氧化能力均显著高于现有产品，乳酸菌发酵可以提升酒体的抗氧化能力。

经乳酸菌发酵改良的酒体，呈金黄色，具有柑橘类水果香气，酒香、果香馥郁柔和，口感爽口、清新，产品品质出色，具备较好的市场潜力。