堆积酒醅中酵母菌代谢的分析研究

曹润洁，周鹏磊 ，何宏魁，李安军，汤有宏，芮君君

（1.安徽古井贡酒股份有限公司，安徽亳州236800； 2.安徽瑞思威尔科技有限公司，安徽亳州236826）

芝麻香型白酒兼具有浓香型、清香型和酱香型白酒的独特风味[1-6]，已是白酒酿造行业发展最快的香型之一。芝麻香型白酒堆积酒醅中含有丰富的微生物群落[7]，堆积酒醅中的酵母菌作为乙醇代谢的核心功能菌群之一，对白酒发酵过程中产香产酯也发挥着特有的贡献[8]。根据酵母菌在芝麻香型白酒堆积发酵过程中作用不同可分为两类酵母菌[9]：一类是在发酵堆积过程起到产酒功能的酵母菌[10-11]，主要是酿酒酵母，发酵能力强，影响芝麻香型白酒的产酒率；另一类是在发酵堆积过程起到生香作用的酵母菌[12-13]，即产酯酵母，包括假丝酵母、产膜酵母、异型汉逊酵母等，对芝麻香型白酒微量香气物质的形成起着重要作用。多种多样的酵母能在酯酶的作用下合成其他风味物质，从而赋予芝麻香型白酒酒体浓郁的芳香，对酒体的丰满具有重要作用。

本研究对堆积酒醅中的酵母菌进行了筛选和鉴定，从中选出了3株不同种属的酵母菌进行发酵代谢研究，以期能够了解芝麻香型白酒酒醅堆积过程中相关酵母菌的产酒和风味代谢，为今后酒醅堆积发酵过程调控提供一定的理论指导，最终实现芝麻香型白酒的酒体品质提升。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 样品

样品取自安徽某酒厂调味酒生产车间，待酒醅堆积发酵32 h时左右取样，样品4℃存放备用。

1.1.2 仪器与试剂

SX-700型高压灭菌锅，日本TOMY；BPG-9240A型精密鼓风烘干箱，上海一恒；ME204E型电子分析天平，梅特勒·托利多公司(上海）；BSP-150型生化培养箱，上海博迅实业有限公司；ZWY-304型恒温培养振荡器，上海智诚分析仪器制造有限公司；PCR仪，Thermo Scientific公司；核酸微量测定仪，Maestro Nano公司；7890B气相色谱仪，美国Aglient公司；BSC-1300ⅡA2型生物安全柜苏净集团；真菌基因组提取试剂盒，购自上海生工。

1.1.3 培养基

筛选培养基：氯霉素2 g，麦芽汁粉130.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1000 mL，pH6.0±0.2。

发酵培养基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉0.3 g/L，麦芽浸粉0.3 g/L，(NH4)2SO 45 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L。

1.2 试验方法

1.2.1 筛菌培养

取芝麻香堆积32 h后的酒醅25 g于225 mL灭菌后的蒸馏盐水中，室温放入摇床中振荡30 min；振荡液进行梯度稀释至 10-6，分别取 10-4、10-5、10-6稀释液0.2 mL涂布到筛选培养基上，涂布均匀后置入30℃培养箱中，倒置培养2～3 d后，便可进行酵母菌菌落形态的观察、分离和纯化，并斜面保存菌种。

1.2.2 菌种基因提取

试剂盒提取酵母菌DNA，扩增待鉴定菌株的26S rDNA序列，PCR反应体系为：待鉴定菌株的染色体 DNA 1μL，10×PCR 缓冲液 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，上游引物(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')及下游引物(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')各0.5 μL，补水至50 μL；PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，经过30个循环后，72℃再延伸10 min。

1.2.3 代谢物检测方法

酸、酯、乙酸乙酯含量检测方法依据GB/T 10345—2007；醇和醛含量检测方法依据GB/T 11856—2008。

1.2.4 酸性条件下酵母菌发酵培养

调节发酵培养基pH值为3.5，取150 mL发酵培养基分装到三角瓶中，利用接种环挑取纯化后的酵母菌接种到含150 mL培养基三角瓶中，恒温32℃，摇床转速150 r/min，发酵培养3 d，取发酵液依1.2.3中方法检测发酵代谢物含量。

1.2.5 碱性性条件下酵母菌发酵培养

调节发酵培养基pH值为7.5，取150 mL分装到三角瓶中，利用接种环挑取纯化酵母菌接种到含150 mL培养基三角瓶中，恒温32℃，摇床转速150 r/min，发酵培养3 d，取发酵液依1.2.3中方法检测发酵代谢物含量。

1.2.6 酵母菌失重培养

高粱和自来水1∶5混合后蒸煮1～2 h，加入淀粉酶液化，液化后补加60℃温水一份，再按原料量的5%加入糖化酶（5万活力单位），搅拌均匀，60℃糖化3～4 h，用稀碘液试之不显蓝，再加热至90℃，用细白布过滤，糖度计测量并调整糖度为12°Bx。取50 mL糖化液加入100 mL三角瓶，塞上棉塞，外包油纸，加发酵栓，0.1 MPa灭菌20 min后，待冷却至28℃时，在无菌条件下分别接入10%种子液，装好发酵栓并按要求注入硫酸后，密封擦干称重。置入30℃培养箱中发酵72 h，中间轻摇称重及检测酒精度。

1.2.7 3株酵母混菌发酵

利用发酵培养基培养毕赤酵母、酿酒酵母、异常威客汉姆酵母、毕赤酵母+酿酒酵母、异常威克汉姆酵母+酿酒酵母、毕赤酵母+酿酒酵母+异常威克汉姆酵母，种子细胞浓度达到108cfu/mL，然后按4%接种量接种到发酵培养基中，恒温32℃，摇床150 r/min振荡，发酵培养3 d，取发酵液依1.2.3中方法检测发酵代谢物含量。

2 结果与分析

2.1 芝麻香酒醅酵母菌分离与鉴定

堆积酒醅中的酵母菌经过培养、分离、纯化，一共挑选出可疑菌株15株，对15株菌分别进行形态观察，基因提取，PCR扩增后分子测序，测序的分子序列在BLAST数据库中进行比对后最终筛选出3株不同种属的酵母菌，分别标记为酿酒酵母Y1、毕赤酵母Y2、异常威克汉姆酵母Y3。

2.2 碱性条件下酵母菌代谢特征研究

由图1可知，酵母菌在碱性条件发酵时，异常威克汉姆酵母所产的风味物质乙酸乙酯、总酯和风味物质总量较其他2株酵母高，其中乙酸乙酯和总酯的产量明显高于毕赤酵母和酿酒酵母。3株酵母产酸量顺序：酿酒酵母＞毕赤酵母＞异常威克汉姆酵母；3株酵母产醛类物质的量相当。

图1 碱性条件下酵母菌代谢

2.3 酸性条件下酵母菌代谢特征研究

由图2可知，酵母菌在酸性条件发酵时，异常威克汉姆酵母的乙酸乙酯和总酯合成量远高于毕赤酵母和酿酒酵母。发酵产酸类物质含量的趋势为：酿酒酵母＞毕赤酵母＞异常威克汉姆酵母；产醛和醇类物质含量三者相当；产风味物质总量趋势为：异常威克汉姆酵母＞酿酒酵母＞毕赤酵母菌。

图2 酸性条件下酵母菌代谢

2.4 发酵失重和产酒代谢研究

由图3可知，0～48 h内酿酒酵母菌所在的发酵组发酵失重量均较异常威克汉姆酵母和毕赤酵母单株发酵失重量大，发酵72 h时达到相对一致的失重量，异常威克汉姆酵母失重量较毕赤酵母高；由图4可知，有酿酒酵母菌存在的发酵组，酒精度达到了6%vol以上，单独发酵的异常威克汉姆酵母、毕赤酵母以及二者组合酒精度均在5%vol以下，由此可以看出，异常威克汉姆酵母、毕赤酵母均具有一定的产酒代谢能力，酿酒酵母在芝麻香酒醅中是主要的产酒酵母。

图3 混合酵母菌发酵失重

图4 混合酵母菌发酵产酒

2.5 混菌发酵代谢研究

由图5可知，酸性(pH3.5)环境下异常威克汉姆酵母表现出较高的酸类、酯类及醇类物质产量；混菌发酵时产风味物质总量较大的是异常威克汉姆酵母以及异常威克汉姆酵母与毕赤酵母的组合，试验表明毕赤酵母不影响异常威克汉姆酵母发酵产香，但酿酒酵母存在时风味物质产量显著降低，这可能是酿酒酵母产的酒精抑制了其他酵母的生长代谢。

图5 混合酵母菌代谢

3 结论

芝麻香型白酒堆积酒醅中的3种酵母菌发酵时，均表现出酸性条件下较碱性条件下产风味物质的总量大。酸性条件下酿酒酵母产生醛类和酸类物质增多，同时有利于酿酒酵母和异常威克汉姆酵母产生风味物质，其中异常威克汉姆酵母产乙酸乙酯更高，而毕赤酵母在偏碱的环境中产风味物质。酒精发酵试验结果显示，有酿酒酵母参与的发酵体系，乙醇含量都在较高的水平，而另一方面，酿酒酵母的参加降低了总风味物质的合成，特别是乙酸乙酯。由此可以看出酿酒酵母在芝麻香型白酒堆积发酵过程中主要起到产酒作用，异常威克汉姆酵母和毕赤酵母主要起到产香作用。