利用GC×GC-TOFMS鉴定包包曲中的游离香气成分

郑 佳，赵 东，何张兰，张建敏，刘志鹏，杨康卓，乔宗伟

（宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾644000）

我国大曲根据制曲过程中顶温的高低，可划分为中温大曲、中高温大曲和高温大曲，而正是由于品温的高低差异以及曲房内温湿度的影响，引起不同类型大曲培曲过程中微生物菌群的差异显著，进而造就了不同类型大曲的酶活力和香气特征差异显著[1]。大曲不仅为白酒发酵提供微生物类和酶类，还为白酒发酵提供丰富的曲香类成分，但是，迄今对白酒曲香的成因以及特征组分的研究还十分欠缺。

多种前处理方法应用于大曲风味的研究，如顶空固相微萃取、溶剂萃取等[2-6]。近来，我们利用多种萃取方法结合GC-MS研究了五粮液包包曲中的风味成分[7]。假设发酵过程中大曲自身风味成分没有发生代谢变化，在糟醅发酵结束后的蒸馏过程中，大曲的风味成分必将随着蒸汽进入基酒，进而影响白酒酒体风味特征。但是，对大曲自身游离态的香气成分的构成，尤其是随蒸馏进入蒸馏液中游离风味成分的认识还需要大量研究。

因此，本研究的目的就是利用全二维气相色谱-飞行时间质谱研究包包曲中自身游离态的香气成分，对科学认识包包曲对白酒酒体风味中曲香的贡献度具有极其重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：生产用包包曲粉，采自宜宾五粮液股份有限公司酿酒车间。

试剂及耗材：二氯甲烷和甲醇均为HPLC级，购自百灵威公司；正戊烷，分析纯，成都科龙化工厂；无水硫酸钠，ACS级，购自阿拉丁公司；固相萃取柱（SPE柱，填料为LiChrolut EN，0.2 g/3mL），购自德国Merck公司。

仪器设备：全二维气相色谱-飞行时间质谱仪（GC×GC-TOFMS）由Agilent 7890B气相色谱（Agilent Technologist，美国）、Pegasus 4D飞行时间质谱仪（LECO，美国）和多功能自动进样器（Gerstel，ML2，德国）组成；调制器（LECO，美国）为液氮型调制器；全二维气相色谱由一维气相色谱柱箱和安装在其内的独立控温的二维色谱柱箱构成。一维色谱柱为极性柱DB-WAXext（30 m×0.25 mm×0.25 μm，J&W，美国），二维色谱柱为中等极性柱Rxi-17Sil MS（1.6 m×0.1 mm×0.1 μm，Restek，美国）。

1.2 试验方法

1.2.1 包包曲清蒸

称取1 kg样品于自制不锈钢小甑桶中（甑容为10 L），底锅中加入2 L蒸馏水，打开电炉蒸馏20 min，收集所有蒸馏液。

1.2.2 香气成分提取

吸取20 mL样品蒸馏液，上样于预先分别经过5 mL二氯甲烷、甲醇和蒸馏水平衡的SPE柱，保持3～5 mL/min流速，上样结束后，用5 mL蒸馏水洗涤填料，真空下干燥，再加入3 mL二氯甲烷洗脱，温和N2吹扫浓缩至0.25 mL。

1.2.3 GC×GC-TOFMS条件

GC条件：进样口温度230℃，一维柱箱起始温度45℃，保持3 min，再以5℃/min升温至230℃并保持10 min。GC二维柱箱全程保持比一维柱箱高5℃。调制补偿温度20℃。调制周期为4 s（热脉冲时间0.8 s）。色谱柱采用恒流模式，载气为高纯氦气（纯度＞99.999%），流速为1 mL/min。进样口为不分流进样方式，进样量为1 μL。

TOFMS条件：GC连接线温度240℃，电离电压-70 eV，离子源温度230℃，检测器电压1430 V，质量数范围35～400 amu，数据采集频率100 spectra/s。

1.2.4 数据处理

参考文献所述方法[8]，采用ChromaTOF软件进行自动解卷积和谱库（mainlib,standards,NIST和replib）比对，并结合香气成分标准物质保留时间、待测物质的保留指数与文献报道值等进行物质的综合鉴定。选择相似度大于800、信噪比大于50的组分作为主要分析对象。

2 结果与分析

2.1 二维总离子流图

假设包包曲中的风味物质在窖池发酵过程中并未发生变化，由此，在完成发酵之后，糟醅蒸馏过程中之前加入的包包曲中风味物质势必会随蒸汽而蒸馏出，并在白酒酒体中富集。在此种条件下，采用清蒸包包曲的方式获取包包曲在模拟蒸馏条件下挥发性风味成分，并利用SPE萃取浓缩得到包包曲的风味物质，最后利用GC×GC强大的色谱分离能力以及TOFMS高速扫描速度和自动解卷积能力，获得了包包曲的挥发性风味物质二维总离子流图（图1）。由图1可知，绝大部分的风味物质在调制时间3 s以内出峰，全二维色谱图清晰的显示出了包包曲中的风味物质。图1(B)中主要的物质包括戊醛、己醛、2-戊醇、正丁醇、2-庚酮、正戊醇和己酸乙酯；图1(C)中主要的物质是吡嗪类物质，包括2,3-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪等；图1(D)中主要的物质包括芳香族和内酯类，如苯乙醛、苯乙醇、4-乙烯基愈创木酚等。

图1 包包曲清蒸液中香气成分的二维总离子流图

2.2 主要香气成分

采用Pegasus 4D飞行时间质谱仪自带工作站软件ChromaTOF对NIST质谱库的检索结合单一标准物质质谱和保留时间、文献保留指数等综合对比，共定性得到209个化合物，其中以醇类、芳香族、醛类、吡嗪、酮类为主，分别检出了34个、30个、22个、21个和26个。

图2 包包曲中各类型化合物数量

2.3 典型的风味成分

2.3.1 吡嗪类

吡嗪类物质是白酒中主要的含氮化合物。这类物质主要呈现巧克力、坚果、花生味等香气，被认为是大曲中焦香味、烘焙味的主要来源[4]。由于其阈值较低，因此对白酒香气具有特殊的贡献，但由于其含量较低，为其鉴定及定量造成了一定困难。本研究结合了SPE的选择吸附能力以及GC×GCTOFMS的全扫描功能，提供了一种可靠的方法，可准确鉴定白酒或包包曲中的吡嗪类物质。

表1 包包曲中的游离吡嗪类化合物

本研究中共检出21种吡嗪类物质，如表1所示。首次在包包曲中检测到的吡嗪类物质有吡嗪、2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪、2-乙酰基吡嗪、2,5-二甲基-3-(3-甲基丁基)-吡嗪、4-甲基吡咯并[1,2-a]吡嗪。以面积归一法定量分析可知，2-甲基吡嗪含量最高（相对峰面积比为3%），其次为2,6-二甲基吡嗪（3%）、三甲基吡嗪（2%）、2,3-二甲基吡嗪（1%）、2,5-二甲基吡嗪（1%）、四甲基吡嗪（1%）。

吡嗪类化合物主要由大曲发酵过程中氨基酸、蛋白质等发生美拉德反应产生或有酶参与的褐变反应产生，除此之外，也可以由微生物在曲药中迅速繁殖并代谢产生[9-10]。研究表明[11]，在包包曲的生产过程中，吡嗪类物质随着发酵时间增加而增加，并且降温阶段是吡嗪类物质产生的主要时期。

2.3.2 芳香族

本研究中共检出30种芳香类物质（表2），包括芳香酮类8种，芳香醛类6种，酚类5种，芳香醇类4种，芳香酯类2种，萘2种，吡啶1种，吲哚1种。其中首次在包包曲中检测到的物质有1-苯基-2-丙酮、3-甲基苯乙酮、4-甲基苯乙酮、2-苯基丙烯醛、2-苯基-1-丙醇、α-亚乙基-苯乙醛、3,4-二甲基苯乙酮、DL-β-乙基苯乙基乙醇、2-甲基苯酚、4-甲氧基苯甲醛、5-甲基-2-苯基-2-己醛、1-四甲基萘酮、己酸苯乙酯、3-氨基苯乙酮、3-苯基吡啶、二苯甲酮、3-甲基吲哚。采用峰面积归一法定量，包包曲中含量最高的芳香类物质为苯乙醇（10%），其次为苯乙醛（10%）、苯甲醛（2%）、苯乙酮（2%）以及苯酚（1%）。

表2 包包曲中的游离芳香族化合物

芳香类物质是赋予大曲丰富且复杂气味的一类化合物，主要贡献花香、甜香等香气。有研究发现[12]，苯乙醛在浓香型大曲中的香气稀释因子（FD=243），具有重要的香气贡献。

酚类物质是一类具有特殊香气的芳香类化合物，如苯酚呈现一种类似墨水、西药的刺激性气味，4-乙烯基愈创木酚贡献典型的烟熏味，对甲酚贡献类似马厩味，愈创木酚在低浓度时呈现水果香、甜香的香气，2-甲基苯酚呈现西药、墨水的气味。前四者在46%vol乙醇水溶液中的嗅觉阈值分别为：18.91 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、13.41 mg/L；2-甲基苯酚在水中的阈值为0.25 mg/L[13]。有研究表明[14]，4-乙烯基愈创木酚是赋予酱油特殊酱香味的挥发性风味成分，其来源可能是制曲温度超过60℃时，原料中的阿魏酸逐步释放后在微生物作用下形成的。

2.3.3 醛类

如表3所示，共鉴定出醛类物质22种，包括不饱和醛14种、直链饱和醛6种以及支链饱和醛2种。其中首次在包包曲中检出的物质包括：戊醛、2-甲基戊醛、巴豆醛、(E)-2-戊烯醛、庚醛、2-己烯醛、辛醛、(E,E)-2,6-壬二烯醛、(E)-2-癸烯醛、(E,Z)-2,4-癸二烯醛。按面积归一法定量，己醛含量最高（相对峰面积比为7%），其次为2-庚烯醛（3%）、戊醛（2%）、3-甲基丁醛（1%）以及壬醛（1%）。

表3 包包曲中的游离醛类化合物

饱和醛类物质包括3-甲基丁醛（异戊醛）、戊醛、2-甲基戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛。这类物质主要呈现花香、水果香、青草味等香气，对包包曲的整体香气具有明显的贡献，在46%vol酒精水溶液中的阈值分别为17 μg/L、725 μg/L、33 μg/L（40%vol）[15]、25 μg/L、410 μg/L、40 μg/L、122 μg/L和71 μg/L。

包包曲中含有大量的不饱和醛，这些物质在包包曲的香气贡献上具有至关重要的作用，其可能来源于多不饱和油脂在加热条件下的氧化[16]。

2.3.4 呋喃类

共检出21种呋喃类化合物（表4），其中首次在包包曲中检出的物质有：2-甲基四氢呋喃-3-酮、3-糠醛、3-甲基-4-戊内酯、γ-戊内酯、3-甲基-4-丁内酯、5-甲基-2-呋喃甲醇、2(5H)-呋喃酮、四氢糠醇、(+/-)-β-羟基-γ-丁内酯、泛酰内酯、γ-壬内酯、4-甲基-5,6-二氢吡喃-2-酮、2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮、2,3-二氢苯并呋喃。由面积归一法定量结果，2-甲基四氢呋喃-3-酮含量最高（相对峰面积比为3%），其次为(+/-)-β-羟基-γ-丁内酯（3%）、糠醛（2%）、糠醇（1%），以及泛酰内酯（1%）。

表4 包包曲中的游离呋喃类化合物

呋喃类化合物是白酒中一类重要的呈香化合物，并具有功能性，这类化合物是一类含氧的五元杂环物质，主要呈现典型的焦香味。其中，糠醇、糠醛以及2-乙酰基呋喃被认为是白酒中重要的呋喃类物质[17]。

内酯类化合物是一类特殊的呋喃类物质，主要呈现果香、米香、甜香等香气特征，本研究共检出8种，包括3-甲基-4-戊内酯、γ-戊内酯、3-甲基-4-丁内酯、丁内酯、γ-己内酯、(+/-)-β-羟基-γ-丁内酯、泛酰内酯、γ-壬内酯。

2.3.5 硫化物

本研究共检出硫化物7种（表5），首次在包包曲中检出的物质有：噻唑、四氢噻吩-3-酮、2-乙酰基噻唑、苯并噻唑。含量最高的硫化物为2-乙酰基噻唑（相对峰面积比为2%），其次为3-甲硫基丙醛（1%）、苯并噻唑（1%）、二甲基三硫（0.24%）以及二甲基二硫（0.22%）。

表5 包包曲中的游离含硫化合物

硫化物在白酒中含量非常低，但是由于其具有更低的阈值和强烈的气味，使得这类化合物在白酒的风味中具有极其重要的地位[18]。一般来说，硫化物的风味具有双重作用，即浓度较低时，对白酒的风味起着积极的促进作用，而浓度较高时，则会对白酒的风味造成不利的影响[13]。这类物质一般呈现洋葱、臭鸡蛋、烂白菜等异嗅味。其中2-乙酰基噻唑呈坚果、烘焙香气，在水中的嗅觉阈值低至1 μg/L。3-甲硫基丙醛是饮料酒中最常见的甲硫基醛类物质，呈土豆气味；苯并噻唑呈橡胶、汽油气味；二甲基三硫呈腐臭、烂白菜味，并且气味阈值极低；二甲基二硫具有明显的大蒜气味，它们在46%vol酒精水溶液中的嗅觉阈值分别为 7.12 μg/L、50 μg/L、0.36 μg/L和9.13 μg/L。硫化物的极低含量以及特殊性质为其鉴定工作造成了一定困难。本研究提供了一种可鉴定白酒生产过程样品的硫化物的方法。

2.3.6 醇类

包包曲中检测出的醇类物质种类最多（34种，表6），包括直链醇10种、支链醇10种、不饱和醇11种以及多元醇3种。首次在包包曲中检出的醇类物质包括：2-甲基-3-丁烯-2-醇、3-甲基-2-丁醇、2-丙基-1-戊醇、1-戊烯-3-醇、3-戊烯-2-醇、(Z)-2-丁烯-1-醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、2-癸醇、乙二醇乙醚、异戊烯醇、(E)-2-己烯-1-醇、(Z)-2-己烯-1-醇、5-己烯-1-醇、6-氨基-1-己醇、2-丙基-1-庚醇、1-癸醇、(S)-(-)-1,2,4-丁三醇、十二醇、乙二醇单十二烷基醚。根据面积归一法定量结果可知，2-丙基-1-庚醇的含量最高（相对峰面积比为4%），其次为3-甲基丁醇（3%）、1-己醇（3%）、1-戊醇（2%）。

表6 包包曲中的游离醇类化合物

醇类物质是赋予白酒特殊口感的一类重要的风味化合物，味觉上来说多数具有甜味，而气味上来说则各不相同。有研究表明，2-丁醇、3-甲基丁醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇对浓香、清香、酱香3种香型白酒的酒曲香气都具有一定的贡献[19]，这几种重要的醇类物质在本研究中均被检出。其中2-乙基-1-己醇在浓香型白酒大曲中的香气强度最大，呈现典型的青草香；3-甲基丁醇（异戊醇）具有醇香、水果香，是白酒中杂醇油的主要成分之一。2-丁醇对清香型白酒大曲的香气贡献较明显，呈现典型的花果香；1-壬醇呈黄瓜香气，对浓香、清香、酱香3种香型白酒大曲的香气都有一定的贡献。

除此之外，1-辛烯-3-醇具有强烈的蘑菇味、土腥味，在46% vol酒精水溶液中的阈值仅6.12 μg/L，对白酒具有重要的香气贡献；前期研究中也在白酒大曲中检测到该物质，并推断该物质与大曲的霉味具有一定的关联性[4]。

3 结论

本研究采用清蒸法获得了五粮液生产用包包曲粉中的游离香气成分，再利用SPE结合GC×GCTOFMS技术共鉴定出挥发性化合物209种，其中有68种物质为首次在包包曲中发现，这些物质大多数已经被证明是白酒中重要的香气贡献物质。采用的方法结合了SPE的选择性吸附及GC×GCTOFMS的高扫描速度与自动的解卷积功能，可在包包曲中发掘更多的微量成分。