加减益经汤对卵巢功能减退大鼠性激素与卵巢组织形态学的影响*

李丽美，和秀魁，蔡仁燕，黄雪萍，夏建红

（广东省妇幼保健院，广东 广州 510095）

卵巢功能减退（diminished ovarian reserve，DOR），又称卵巢储备功能下降，指卵巢产生卵子的能力减弱，卵泡的质量下降[1]。DOR临床表现严重程度不一，或无症状，或仅表现为生育力的下降，或有月经不调、不孕，进一步发展为卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）、卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）。DOR的治疗是临床的难点与热点。西医尚无确切有效的方法提高卵巢储备功能，中医改善卵巢功能的疗效与机制尚不明确。研究发现加减益经汤可明显改善卵巢储备功能，提高妊娠率[1-3]，但机制尚不明确。临床上环磷酰胺（cytoxan，CTX）化疗是引起DOR、POI、POF的主要原因。前期研究采用75 mg/kg CTX单次腹腔注射成功复制DOR大鼠模型[1,4-6]。本实验以戊酸雌二醇片（商品名：补佳乐）为阳性对照，探讨加减益经汤对CTX建立的DOR大鼠性激素与卵巢组织形态学的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物12周龄健康SPF级SD成年雌性大鼠60只，体质量（230±10）g，购自广东省医学实验动物中心。均经阴道脱落细胞涂片筛查动情周期正常。全价颗粒饲料喂养，自由摄食，标准光照，室温20～25℃，相对湿度45%～55%。动物合格证号：NO.44007200002182，实验设施合格证号：SCXK（粤）2013-0002。本实验经医学实验动物管理委员会批准。

1.2 药物与试剂 加减益经汤由熟地黄20 g，党参20 g，菟丝子20 g，丹参15 g，白芍10 g，当归10 g，柴胡6 g等中药组成[1,6-7]。将上述药物煎制后浓缩为每毫升含生药2.358、1.179、0.589 5 g的药液，装瓶低温冷藏备用（广东省中医研究所制备），应用时以蒸馏水调配[1]。戊酸雌二醇片（商品名：补佳乐，法国DELPHARM Lille S.A.S公司，1 mg/片，批号：251A2）；CTX（山西普德药业有限公司，0.2 g/支，批号：04130301）；E2ELISA试剂盒（批号：1306246）、FSH ELISA试剂盒（批号：1306251）、LH ELISA试剂盒（批号：1304252）（上海西唐生物科技有限公司）。

1.3 主要仪器Bio-RAD 680酶标仪（美国伯乐公司）；Olympus DP2-BSW型病理图像采集系统（日本奥林巴斯公司）。

1.4 造模与分组 将60只SD雌鼠按随机数字表选出10只为空白对照组，予1 mL生理盐水腹腔注射。其余50只雌鼠予CTX 75 mg/kg（加生理盐水配成1 mL药液）单次腹腔注射造模[1,4-5]。CTX造模后大鼠出现蜷卧少动，精神不振，易激惹等表现，提示造模成功，将造模成功大鼠随机分为模型对照组、补佳乐组和加减益经汤高、中、低剂量组，每组10只。

1.5 实验给药 加减益经汤高、中、低剂量组大鼠参考《中药药理研究方法学》[8]，分别灌胃高、中、低剂量加减益经汤，生药剂量分别为23.58、11.79、5.895 g/kg。补佳乐临床常规日用量1 mg，参考《中药药理研究方法学》[8]，补佳乐组大鼠灌胃补佳乐混悬液，0.09 mg/kg。模型对照组与空白对照组大鼠灌胃蒸馏水，10 mL/kg。造模后2 h开始灌胃给药，1次/d，连续28 d。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠动情周期 每天08:30:00行阴道脱落细胞检查[9]。模型对照组大鼠在造模后2周，其余各组在结束给药后，筛查出处于动情间期的大鼠，断颈处死。

1.6.2 血清性激素水平 腹主动脉取血，室温下静置30 min，3 000 r/min，离心10 min，分离血清置于-80℃冰箱保存待测[1,4,6]。以双抗体夹心ELISA法测定大鼠血清中FSH、LH、E2水平。

1.6.3 卵巢指数 完整取出大鼠双侧卵巢，去掉筋膜及脂肪组织，称重后计算卵巢指数[卵巢指数=卵巢湿质量（mg）/体质量（g）×100%][10-11]。

1.6.4 卵巢组织形态学观察及卵泡计数 左侧卵巢置福尔马林固定，经脱水、包埋、切片、HE染色、封片，光镜下观察组织形态学变化。病理切片为连续5 μm切片，每间隔9张取1张切片（即第10张），随机取5张，累积计数原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡和闭锁卵泡数目[1,5-6]。

1.7 统计学方法 数据采用SPSS 21.0 For Windows统计分析软件进行处理，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况 各组大鼠全部存活。空白对照组大鼠均表现正常；模型对照组大鼠造模后开始出现被毛疏松易脱落，蜷卧少动，精神不振，易激惹等情况；各治疗组造模后出现模型对照组的表现，但药物干预后逐渐恢复正常，且恢复较模型对照组快。

2.2 各组大鼠动情周期比较 空白对照组大鼠动情周期4～5 d，中位数4.5 d，动情间期1.5～2.5 d，中位数2 d；模型对照组大鼠造模后规则的动情周期变化消失，延长至7 d以上，动情间期时间5～7 d，中位数6 d；药物干预后，加减益经汤高、中剂量组和补佳乐组大鼠逐渐恢复正常的动情周期，而加减益经汤低剂量组大鼠观察期内未恢复正常的动情周期。

2.3 各组大鼠卵巢指数比较 与空白对照组比较，补佳乐组与模型对照组大鼠卵巢指数明显降低（P＜0.01）；与模型对照组比较，加减益经汤高、中剂量组大鼠卵巢指数明显升高（P＜0.01）；与补佳乐组比较，加减益经汤高剂量组大鼠卵巢指数明显升高（P＜0.05）。（见图1）

图1 各组大鼠卵巢指数比较（±s，n=10）

2.4 各组大鼠卵巢组织形态学 空白对照组大鼠卵巢皮髓质结构清晰，各级卵泡及黄体形态结构完整，血管丰富，髓质充盈，含有丰富的神经、淋巴管；模型对照组大鼠卵巢髓质部分萎缩，皮质明显增生且纤维化，间质有炎症变化及纤维化改变，颗粒细胞排列疏松，层数减少，原始、成熟卵泡减少，初级、次级、闭锁卵泡增多；各治疗组卵巢髓质未见明显萎缩，皮质增生不明显，间质纤维化程度轻，闭锁卵泡减少，成熟卵泡、黄体增多。（见图2）

图2 各组大鼠卵巢组织形态学比较（HE，×40）

2.5 各组大鼠卵巢各级卵泡数目比较 与空白对照组比较，模型对照组大鼠原始、成熟卵泡数明显减少（P＜0.01），初级、次级、闭锁卵泡数明显增加（P＜0.01）；补佳乐组、加减益经汤低剂量组大鼠成熟卵泡数明显减少（P＜0.01或P＜0.05），初级、次级、闭锁卵泡数明显增加（P＜0.01或P＜0.05）；加减益经汤高、中剂量组次级卵泡数明显增加（P＜0.01）。与模型对照组比较，各治疗组大鼠原始卵泡数明显增加（P＜0.01），初级、次级、闭锁卵泡数明显减少（P＜0.01）；加减益经汤高、中剂量组成熟卵数泡明显增加（P＜0.01或P＜0.05）。与加减益经汤高、中剂量组比较，加减益经汤低剂量组次级卵泡数明显增加（P＜0.01）。（见图3）

图3 各组大鼠卵巢各级卵泡数目比较（±s，n=10）

2.6 各组大鼠血清FSH、LH、E2水平比较 与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清FSH、LH水平明显升高（P＜0.01），E2水平明显降低（P＜0.01）；与模型对照组比较，各治疗组大鼠血清FSH、LH水平明显降低（P＜0.05或P＜0.01），E2水平明显升高（P＜0.01）。（见表1）

表1 各组大鼠血清FSH、LH、E2水平比较（±s，pg/mL）

表1 各组大鼠血清FSH、LH、E2水平比较（±s，pg/mL）

注：与空白对照组比较，aP<0.01；与模型对照组比较，bP<0.01，cP<0.05

组别 动物数（只）给药剂量（g/kg）FSH LH E2空白对照组 10 - 2对照组 10 - 5.08±0.76 4.55±1.88 60.38±7.84模型.86±1.50a 7.83±0.71a 31.20±7.22a补佳乐组 10 9.00×10-5 2.64±0.74b 4.84±2.24b 57.64±8.13b加减益经汤高剂量组 10 23.58 2.47±1.19b 4.77±1.23b 52.94±10.03b加减益经汤中剂量组 10 11.79 2.59±0.72b 4.72±1.07b 52.64±10.93b加减益经汤低剂量组 10 5.895 3.03±0.82b 5.42±1.66c 49.87±8.60b

3 讨 论

卵巢功能由卵巢内的卵泡数目与质量决定，反映女性的生育力[12]。卵巢功能减退时血清E2降低，或卵泡对FSH、LH的敏感性降低，垂体代偿性分泌更多FSH、LH，其中以FSH上升更明显。因此，始基卵泡数是卵巢储备功能的直接反映指标，FSH、LH与E2是评估卵巢功能最常用的指标。

DOR是一种病因复杂且进行性发展的疾病。CTX是对卵巢功能损害最大的药物。CTX主要影响增殖活跃的细胞，使DNA断裂而引起细胞凋亡[13]。研究发现CTX对始基卵泡的损伤最大，通过激活始基卵泡，加速卵泡的耗竭[14]，大剂量使用时，卵巢损伤不可逆转[15]。前期研究证实，75 mg/kg CTX单次腹腔注射可成功复制DOR大鼠模型[1,4-6]。本次实验模型对照组大鼠经CTX75 mg/kg单次腹腔注射造模后，出现蜷卧少动，精神不振，动情周期延长，卵巢颗粒细胞减少，间质炎性改变，原始、成熟卵泡减少，初级、次级、闭锁卵泡增多，血清FSH、LH升高，E2降低，符合DOR的病理改变，证明造模成功。

目前尚无确切有效的方法恢复卵巢功能，若早期诊断DOR并予中医药干预，或许可延缓卵巢衰老的速度，提高卵子的质量。不少研究证实中医药可改善DOR的卵巢功能，但疗效报道不一，且机制不明确。DOR归属于中医的不孕症、月经病等范畴，与《内经》记载的“七七”变化和《傅青主女科》中记载的“年未老而经水断”类似。《傅青主女科》指出：“然则经水早断，似乎肾水衰涸。吾以为心肝脾气之郁者……方用益经汤”。益经汤原方共10味药，以熟地黄、白术为君药，山药、当归为臣药，佐以白芍、北沙参、酸枣仁、牡丹皮，杜仲、柴胡为使药。

陶莉莉认为肾虚是引起DOR的根本病因，与傅青主的“肾水衰涸”一致，治疗上要兼顾肾精亏虚、肾气虚、肾阴虚与肾阳虚[1-3]。此外，当今女性，工作生活压力大，情志因素是诱发DOR的重要病因，与王吉菊等[16]认识一致，认为肾虚肝郁证是DOR患者临床最常见地证型，因此制定了加减益经汤。加减益经汤是在益经汤的基础上加减而成。以熟地黄、菟丝子、党参为君药，杜仲、丹参、北沙参为臣药，当归、白芍为佐药，柴胡为使药，全方配伍合理、简洁，肾、脾、肝、心、肺五脏同调，具有补肾健脾、疏肝活血之功。研究发现[1-3]，加减益经汤能提高肾虚肝郁证DOR患者的临床妊娠率，降低FSH、LH，升高E2。本次实验中，加减益经汤可恢复CTX所致DOR大鼠的整体状态与动情周期[1]，升高卵巢指数，改善卵巢的病理形态，增加原始、成熟卵泡数，降低初级、次级、闭锁卵泡数，降低FSH、LH，升高E2。这与其他研究相似，如徐慧军等[17]研究表明调更益经汤可改善免疫性POF小鼠卵巢的生殖内分泌功能。潘英等[18]研究表明益经汤联合西药治疗POF的疗效显著，能降低FSH、LH水平，提高E2水平，增大卵巢体积，改善卵巢形态。

本次实验还发现加减益经汤高、中剂量组与补佳乐组在改善卵巢功能方面疗效相当，三者无明显差异，加减益经汤低剂量组疗效略差。加减益经汤呈现一定的剂量依赖关系。加减益经汤中剂量，即临床等效剂量，是最适宜的使用剂量，适合临床推广使用。研究发现加减益经汤可改善因CTX导致的DOR大鼠的性激素与卵巢组织形态学，但其作用机制尚不明确，需进一步深入研究。