HPLC法同时测定复方川芎片中6种化学成分的含量

雷秀星，刘利利，倪丹凤

（1.六安市中医院，安徽 六安 237006；2.中国医科大学附属盛京医院，辽宁 沈阳 110032；3.六安市人民医院，安徽 六安 237005）

复方川芎片是由川芎和当归2种中药经过一系列现代提取工艺加工制备而成的中成药。该复方制剂具有活血化瘀、通脉止痛的功效，现代临床上主要用于冠心病稳定型心绞痛属心血瘀阻证者。复方中的川芎为川产道地药材之一，其性味温、辛，主入肝、胆、心包经，具有活血行气、祛风止痛的功效，《神农本草经》将其列为上品之一，入药历史悠久[1-4]；当归是中药组方中使用频率最高的一味中药，历来素有“十方九归”的说法，其性味温甘辛，具有活血止血、调经止痛、润肠通便的作用，在《神农本草经》中被称为“血家之圣药”[5-8]，二者在复方中协同发挥功效。现代化学和药理研究表明，川芎含有多种化学成分，不同化学成分产生不同的药理作用，对心脑血管系统、呼吸系统、肝肾功能等方面均有一定的保护作用，可有效改善冠状动脉血流量、抗血小板聚集和血栓形成、抗氧自由基、降血压，如苯酞类化合物（藁本内酯）、有机酸类化合物（阿魏酸、咖啡酸）、生物碱类化合物（川芎嗪）等，是川芎中主要的活性成分，也是川芎药材常用的定性定量指标性成分；当归药材中主要有挥发油、多糖、氨基酸、有机酸和黄酮等有机成分；阿魏酸、绿原酸、金丝桃苷等，其中绿原酸和金丝桃苷是重要的抗凝血及抗菌活性成分[9-14]。两味药材中均含有阿魏酸，且《中华人民共和国药典》2015年版一部中阿魏酸均为两味药材的定量指标性成分，复方中二者协同作用，共同发挥治疗效果。笔者查阅相关文献知，目前对该复方制剂中指标性成分的含量进行测定的报道鲜见，因此本次实验研究旨在对该复方中6种指标性成分进行定量分析。

据文献报道[15]，对复方制剂中单一指标性成分的含量进行测定难以确保其有效性与质量稳定性的统一。因此，目前亟需在以临床用药安全和有效的前提下，建立复方川芎片中多指标成分的含量测定方法。本研究则采用HPLC-DAD法建立了同时检测该制剂中阿魏酸、咖啡酸、藁本内酯、川芎嗪、绿原酸和金丝桃苷6种指标性成分含量的方法，为该复方的质量控制与评价提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司，包括DAD二极管阵列检测器，四元梯度泵，Empower Pro色谱工作站）；KQ5200 DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XS205DU型电子分析天平（瑞士-梅勒特有限公司）；Milli Pore Advantage A10自动纯水机（美国）。

1.2 试药 对照品：阿魏酸（批号：110773-201012）、咖啡酸（批号：110885-200102）、藁本内酯（批号：111737-201305）和金丝桃苷（批号：111521-200303）纯度均≥98.0%；川芎嗪（批号：110817-200305，纯度≥99.9%）；绿原酸（批号：110753-201415，纯度≥96.2%），6种对照品均购于中国食品药品检定研究院。5批复方川芎片（批号：20180712，20180810，20180909，20181212，20181227，均为市售品，每素片重0.4g）均为各大药店购买；屈臣氏蒸馏水；乙腈（色谱级，Merk公司）；其他试剂（分析纯，天津化学试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Thermo BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；洗脱程序为：0～12 min，10% A，12～30 min，10%→20% A，30～50 min，20%→40% A；体积流量：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：10 μL；检测波长：320 nm。

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取对照品阿魏酸2.42 mg、咖啡酸3.62 mg、藁本内酯2.82 mg、川芎嗪3.12 mg、绿原酸2.65 mg和金丝桃苷2.29 mg，置于25 mL的棕色容量瓶中，缓慢滴加甲醇至刻度线，超声使溶解充分，分别制成质量浓度为94.86、141.9、110.5、124.7、102.0、89.78 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取复方川芎片粉末0.2 g，置于50 mL的锥形瓶中，加25 mL甲醇溶液，称质量，超声提取30 min，取出，冷却，称质量，加甲醇溶液补足失质量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.4 系统适用性试验 将已制备好的混合对照品溶液和供试品溶液按照既定的HPLC-DAD条件进样测定，记录50 min的色谱图（见图1）。结果显示，阿魏酸、咖啡酸、藁本内酯、川芎嗪、绿原酸和金丝桃苷6个色谱峰的分离度均大于1.5，表明所建立的HPLC-DAD方法满足本次实验要求。

图1 混合对照品与供试品HPLC图

2.5 线性关系考察 分别精密吸取0.25、0.5、1.25、2.5、5 mL的阿魏酸（浓度为94.86 μg/mL）、咖啡酸（浓度为141.9 μg/mL）、川芎嗪（浓度为124.7 μg/mL）、藁本内酯（浓度为110.5 μg/mL）、绿原酸（浓度为102.0 μg/mL）、金丝桃苷（浓度为89.78 μg/mL）混合对照品溶液，置于5 mL的棕色容量瓶中，缓慢滴加甲醇溶液至刻度线，即可得到一系列质量浓度的阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷对照品溶液，按照已定的HPLC-DAD色谱条件分别依次进样测定，计算含量。即分别以阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷对照品溶液的质量（X，μg）为横坐标，其各自的峰面积（Y）为纵坐标，分别得出标准曲线回归方程及相关系数。结果显示，在一定的线性范围内，6种指标性成分的线性关系良好。仪器的检测限以3倍的信噪比（S/N=3），定量限以10倍的信噪比（S/N=3）计算。（见表1）

表1 6种指标性成分线性关系

2.6 精密度试验 取同一批次的样品（批号：20180712），按照既定样品制备方法制备和HPLC-DAD色谱方法测试，同一样品溶液连续重复进样6次，计算各指标性成分的含量。结果显示阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷的含有量RSD分别为1.31%、1.25%、1.02%、1.55%、0.95%、1.43%，表明本方法精密度良好。

2.7 稳定性试验 取精密度测试的样品溶液，分别在第0、2、4、6、8、12 h时进样测试。结果显示阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷各成分的峰面积RSD分别为1.03%、1.20%、1.33%、0.34%、0.93%、1.22%，表明在12 h内供试品溶液中的6种指标性成分具有良好的稳定性。

2.8 重复性试验 取同一批次的样品（批号：20180712），共制备6份样品溶液，按照既定样品制备方法和HPLC-DAD色谱方法进行测试。结果显示阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷的含有量RSD分别为1.15%、1.21%、1.03%、0.85%、0.99%、1.02%，表明本次试验方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 取同一批次的样品（批号：20180712）0.1 g，平行精密称取9份，置于50 mL锥形瓶中，每组分别加入阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷对照品溶液，按照样品含有量的50%、100%和150%加入，按照既定样品制备方法制备和HPLC-DAD色谱方法测试，计算各自的回收率值，结果显示6种指标性成分的平均回收率为阿魏酸99.82%（RSD=1.10%）；咖啡酸100.79%（RSD=1.20%）；川芎嗪100.07%（RSD=0.43%）；藁本内酯98.98%（RSD=1.51%）；绿原酸101.22%（RSD=1.23%）；金丝桃苷100.99%（RSD=1.31%），结果显示6种指标性成分的加样回收率良好，基本符合试验方法学要求。

2.10 含量测定 取5批复方川芎片，按照既定样品制备方法制备和HPLC-DAD色谱方法测试，分别进样检测分析，记录各成分的峰面积，计算阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷各自含量。（见表2）

表2 5批样品中6种化学成分含量测定结果（mg/g，n=5）

3 讨 论

复方川芎片是经过一系列现代提取工艺加工制备而成的中成药，该方中川芎和当归协同发挥治疗疾病的作用。笔者在前人研究的基础上，结合该复方的药理实验结果，综合选择可能发挥疗效的阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷6种指标性成分为该制剂的定量指标，并采用HPLC-DAD法对该6种指标性成分的含量进行了同时测定。结果显示，6种指标性成分在既定样品制备方法和HPLCDAD色谱方法下分离度均良好。故本实验选择同时定量分析阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷6种指标性成分，能保证该复方制剂临床的有效性与质量的稳定性。

笔者经文献研究可知，阿魏酸、咖啡酸、藁本内酯分别在波长320 nm处有吸收，川芎嗪、绿原酸和金丝桃苷分别在波长280 nm或254 nm处有吸收，笔者通过全波长扫描发现，川芎嗪、绿原酸和金丝桃苷在波长320 nm处也有明显的吸收，故实验选择320 nm为阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷6种化学成分的检测波长。研究还分别考察了不同的流动相体系（乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水），结果显示，以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相时，阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷6种指标性成分均能达到良好的效果。考察了不同温度（25℃、30℃、35℃）和不同体积流量（0.8、1.0 mL/min）对各色谱峰分离效果的影响，结果显示，30℃的柱温、1.0 mL/min的体积流量，色谱基线平稳、分离度和峰形均有较好的改善。考察了不同厂家和品牌的色谱柱[Agilent EC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Thermo BDS-C18（4.6mm×250mm，5 μm）；Waters XBridgeTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）]对色谱峰的影响，结果显示，阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷的色谱峰在Thermo BDS-C18柱上具有良好的分离度。实验采用单因素考察的方法对样品提取溶剂（无水乙醇、80%乙醇和60%乙醇，甲醇，80%甲醇，60%甲醇，正丁醇）、提取方法（加热回流、浸提和超声提取）、提取时间（10、20、30、45、60 min）等影响因素进行了考察，结果显示，采用甲醇超声提取30 min可使样品中阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷提取完全。

本研究建立了HPLC-DAD法同时测定复方川芎片中阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本内酯、绿原酸和金丝桃苷含量的方法。通过对高效液相色谱分离参数的考察，最终选择最理想的HPLC-DAD检测条件，该方法能较快速、准确地对不同指标性成分的含量进行有效测定，可作为有效评价复方川芎片内在质量的方法之一，保证了临床用药的安全性和有效性。精确对制剂中药有效成分含量的测定，不仅为其他中药复方制剂的质量控制与评价起到借鉴作用，而且也为中药现代化的实现和国际标准的建立奠定了实验基础。