电针“智三针”对血管性痴呆大鼠学习记忆及海马CA1区突触相关蛋白表达的影响*

魏宇唯，谢高宇，唐中生，林 吉，朱正耀，朱世杰，范瑞娟

（贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025）

血管性痴呆（vascular dementia，VaD）是指由于各种脑血管疾病所引起的颅脑功能障碍而出现以记忆、认知等方面的功能减退或消失为主要特征的一种获得性智能损害综合征，是一种慢性进行性疾病[1]。VaD的主要病因之一为脑血管疾病，包括出血性、缺血性脑卒中及其他脑血管疾病[2]，在老年性痴呆患者中此病约占20%，而发展呈慢性阶梯式进展，随着年龄增高而呈明显增加趋势，仅次于阿尔茨海默病（alzheimer disease，AD）[3]。据国内外相关资料报道，VaD是可防治的一种痴呆性疾病，在疾病早期如果给予治疗，病情具有可逆性[4]。

因此，防治VaD已成为亟须研究和解决的问题。突触后致密物-95（postsynaptic density 95，Psd-95）和突触囊泡膜蛋白（synaptophysin，Syp）是两种突触相关蛋白，研究表明，Psd-95和Syp在突触连接中起到了贯通的“桥梁”作用，检测其蛋白含量可一定程度上反映突触传递效能[5]。同时，临床上治疗VaD的疗效确切，其机制可能与突触重塑密切相关，但目前针对电针“智三针”促进突触重塑方面的研究较为缺乏。因此，本实验以电针“智三针”为研究手段治疗VaD大鼠，基于突触可塑性，探讨电针“智三针”改善VaD的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠80只，体质量300～350 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，合格证号：SCXK（湘）2014-0011，经医学实验动物管理委员会批准，饲养于贵州中医药大学动物房。所有大鼠进行分笼饲养，适应性喂养7 d，整个实验过程遵守实验动物伦理学规定，并且符合SPF级实验动物标准。

1.2 药物与试剂 尼莫地平片（亚宝药业集团股份有限公司，批号：190309）；Psd-95兔多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司，货号：bs-0179R）；Syp兔多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司，货号：bs-8845R）；山羊抗兔工作液（北京中杉金桥生物有限公司，货号：SP-9001）；正常山羊血清（北京中杉金桥生物有限公司，货号：ZLI-9021）；浓缩型DAB试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司，货号：K135925C）；预染蛋白Marker（THERMO，货号：26619，批号：00459134）；蛋白酶抑制剂（康为世纪，货号：CW2200S，批号：60345）。

1.3 主要仪器SDZ-Ⅱ型华佗牌电针仪（济南市天桥区铭泰医疗器械商行）；自制大鼠针灸固定器（贵州凯信生物科技有限公司）；XR-XM101型Morris水迷宫图像自动采集和软件分析系统（上海欣软信息科技公司）；EPS-300稳压稳流电泳仪（Tanon）；Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System蛋 白电泳槽（BIO-RAD）；Mini Trans-Blot蛋白转印系统（BIO-RAD）；LIDE 200扫描仪（日本佳能）；DW-86L386立式超低温保存箱（Haier）。

1.4 造模与分组80只大鼠在室温（23±3）℃条件下，给予充足的水和饲料饲养7 d，饲养后非正常死亡3只，取其中65只大鼠采用改良Pulsinelli’s 4四血管阻断法（4-VO）制作VaD大鼠模型。选用质量分数为1%的戊巴比妥钠进行腹腔麻醉（40 mg/kg），将大鼠俯卧固定于操作台上，于枕部第一颈椎水平处做1～2 cm的纵向切口，以第一颈椎上穿出的神经为标志，暴露第一颈椎翼突孔，用电凝针烧灼双侧椎动脉4～5次后缝合切口。将大鼠仰卧固定于操作台上，颈前正中部位做1.0～1.5 cm的纵切口，在气管两侧分离出双侧颈总动脉约1 cm，穿线以备次日用，术后给大鼠腹腔注射青霉素防止感染。次日将完全清醒的大鼠用合适的手法固定，拆开颈部缝合线，提起颈总动脉下的备用线，用微创动脉夹夹闭两侧颈总动脉，夹闭15 min后放开动脉夹，恢复血液供应，缝合切口，将大鼠放在干净的笼中饲养。模型制作成功的标准：在夹闭双侧颈总动脉后意识丧失，昏迷，翻正反射消失，两眼球变苍白，瞳孔散大且对光反射消失。实验过程中凡不符合上述标准或大鼠出现抽搐及死亡视为失败，排除偏瘫和癫痫的大鼠。

最终将造模成功且成活的48只VaD模型大鼠按随机数字表法分为VaD模型组、尼莫地平组和电针智三针组，每组16只。12只未造模大鼠设为假手术组，假手术组仅暴露翼状孔外口，分离颈总动脉，但不烧灼椎动脉，不夹闭颈总动脉。

1.5 实验给药 术后第8天开始治疗，电针智三针组大鼠依据华兴邦《实验动物穴位图谱》，选取百会穴作为参照，于大鼠百会穴正中前下方0.2 mm处取神庭穴，神庭穴两侧旁开0.5 mm处取本神穴，采用大鼠针灸固定器束缚，1寸毫针于皮下平刺，进针0.5寸，连接电针仪，施予20 Hz连续波，持续20 min。尼莫地平组大鼠灌胃给予尼莫地平溶液，20mg/（kg·d），并按电针智三针组相同束缚方法束缚20 min。假手术组与VaD模型组大鼠均灌胃给予蒸馏水，1 mL/100 g，并按电针智三针组相同束缚方法束缚20 min。均于每天9:00:00—12:00:00进行，1次/d，连续20 d。

1.6 观察指标

1.6.1 Morris水迷宫行为学检测 治疗结束后采用Morris水迷宫进行大鼠行为学检测，以第1～6天的定位航行实验和第7天的空间探索实验作为测试的内容。加入1 000 g奶粉至注水的水池中，使水的颜色变为不透明乳白色，同时保持实验过程中室内光线强度一致，并使池内水温维持在（25±2）℃。实验第1～6天进行定位航行实验，将平台放置在第三象限标志处，从另外3个象限依次将大鼠面壁放入水中，大鼠成功登上平台5 s后即终止记录时间，记录时间最长为90 s。第7天撤除平台进行空间探索实验，依次将大鼠按象限放入水中。选取第1～6天定位航行实验第一、二、四象限入水的逃避潜伏期时间变化及第7天空间探索实验目标象限游泳时间及穿越平台次数作为大鼠学习记忆能力的指标的反映。

1.6.2免疫组织化学法检测Psd-95和Syp的表达 水迷宫检测完毕后立即取材，各组按随机数字表法选取6只大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开胸后将灌注针从左心室直入升主动脉并固定，首先快速灌注冲洗使用生理盐水400 mL，随后进行灌注固定改用300 mL 4%多聚甲醛缓缓推入，灌注完毕剥离大脑置于固定液中固定，最后将脑组织包埋，切片后使用免疫组化法进行检测，检测VaD大鼠海马区Psd-95和Syp的表达情况，高倍镜下观察海马区不重叠的6个视野，图像分析系统采用Image-Pro Plus6.0，测定得出采集的所有图像的光密度和面积，计算出每个视野的平均光密度。

1.6.3 蛋白质印迹法检测Psd-95和Syp的表达 各组剩余大鼠行深度麻醉后断头，置于冰上开颅取脑，同时立即剥离出新鲜海马，将海马CA1区组织置于2 mL EP管内，于液氮中存放，全部取材完毕后放于-80℃冰箱保存。实验时选用β-actin作为内参蛋白，蛋白上样量均为40 μg，抗体浓度为β-actin 1∶5 000；Psd-95 1∶600；Syp 1∶3 000。图像分析选用ImageJ软件测定各条带的灰度值做定量分析，结果以目的蛋白/内参的积分光密度值的比值表示。

1.7 统计学方法 使用SPSS 23.0统计软件分析得出的所有实验数据，计量资料以（±s）表示，使用GRAPHPAD PRISM软件制作柱状图。两组比较，满足正态分布条件下，采用配对t检验，多组比较，采用单因素方差分析；不满足正态分布条件下，采用非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Morris水迷宫行为学检测结果 由于脑对缺血较为敏感，脑组织缺血会导致局部脑组织及其功能的损害，组织学变化出现脑水肿及脑细胞坏死，而长时间的严重缺血会引起梗死，造模后部分大鼠脑功能严重受损，产生缺血缺氧乃至死亡，因此采集标本时各组剩余大鼠数量分别为12、13、12、13只。

与假手术组比较，VaD模型组大鼠在2 d后逃避潜伏期明显延长，而第三象限游泳时间和跨越平台次数明显减少（P＜0.05），提示造模成功，大鼠出现明显的学习记忆障碍；与VaD模型组比较，电针智三针组在3、4、6 d逃避潜伏期明显降低、在7 d第三象限游泳时间和跨越平台次数明显增加（P＜0.05），说明电针“智三针”能够在一定程度上改善痴呆大鼠的学习记忆障碍。（见表1～2）

表1 各组大鼠定位航行试验平均逃避潜伏期比较（±s，s）

表1 各组大鼠定位航行试验平均逃避潜伏期比较（±s，s）

注：F时间主效应=67.004，P时间主效应=0.000；F分组主效应=20.282，P分组主效应=0.000；F交互效应=7.383，P交互效应=0.000；与假手术组比较，aP＜0.05；与VaD模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只） 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d F P假手术组 12 84.52±12.39 56.78±14.5 42.08±15.65 39.63±14.78 25.21±10.55 20.15±21.57 29.479 0.000 VaD模型组 13 82.53±13.19 83.49±6.99a 75.62±18.26a 64.54±23.20a 61.06±24.45a 57.07±23.06a 7.160 0.000尼莫地平组 12 84.59±10.37 72.57±14.81b 50.78±15.36b 49.68±15.94b 39.95±13.85b 27.34±11.17b 22.914 0.000电针智三针组13 86.61±8.76 67.73±16.57 59.40±18.18b 37.95±13.31b 49.53±22.14 37.26±21.17b 20.380 0.000 F 0.281 8.188 8.922 6.394 8.050 8.159 P 0.839 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000

不同组别大鼠逃避潜伏期与时间存在交互效应，随时间的增加，各组逃避潜伏期时间逐渐下降。以假手术组下降幅度最大，电针智三针组在1～4 d呈下降趋势，5 d有小幅上升，6 d下降达到最低，VaD模型组下降幅度最小。（见图1）

图1 大鼠逃避潜伏期时间的交互效应轮廓图

表2 各组大鼠空间探索实验第三象限活动时间和穿越站台次数比较（±s）

表2 各组大鼠空间探索实验第三象限活动时间和穿越站台次数比较（±s）

注：与假手术组比较，aP<0.05；与VaD模型组比较，bP<0.05

组别 动物数（只） 第三象限游泳时间（s）穿越平台次数（次）假手术组 12 54.07±13.11 7.50±2.64 VaD模型组 13 25.66±10.44a 2.38±1.60a尼莫地平组 12 46.42±11.16b 5.75±2.05b电针智三针组 13 42.46±15.46b 4.92±1.61b

2.2 各组大鼠海马CA1区PSD-95、Syp平均光密度值比较Psd-95、Syp的免疫产物呈黄色或棕黄色颗粒状，与假手术组比较，VaD模型组大鼠海马CA1区Psd-95、Syp的免疫产物明显减少，平均光密度值明显下降（P<0.05）；与VaD模型组比较，尼莫地平组与电针智三针组大鼠海马CA1区的Psd-95、Syp的免疫产物明显增多，平均光密度值均明显升高（P<0.05）。（见表3、图2）

图2 各组大鼠海马区Psd-95、Syp免疫组织化学染色图（×400，标尺=40 μm)

表3 各组大鼠海马CA1区Psd-95、Syp平均光密度值比较（±s）

表3 各组大鼠海马CA1区Psd-95、Syp平均光密度值比较（±s）

注：与假手术组比较，aP<0.05；与VaD模型组比较，bP<0.05

组别 动物数（只） Psd-95 Syp假手术组 6 0.22±0.02 0.20±0.02 VaD模型组 6 0.18±0.01a 0.17±0.01a尼莫地平组 6 0.20±0.02b 0.19±0.01b电针智三针组 6 0.19±0.01b 0.19±0.01b

2.3 各组大鼠海马CA1区Psd95、Syp蛋白表达比较 与假手术组比较，VaD模型组大鼠海马CA1区Psd-95与Syp的条带较窄，颜色较浅，蛋白表达量明显减少（P<0.05）；与VaD模型组比较，电针智三针组与尼莫地平组大鼠海马CA1区Psd-95与Syp的条带较宽，颜色较深，蛋白表达量明显增加（P<0.05）。（见图3）

图3 各组大鼠海马CA1区Psd-95、Syp蛋白表达比较（±s）

3 讨 论

针灸学家靳瑞所创“智三针”由神庭、本神（双）三穴组成，所取均是与神相关的穴位并位于前额上，“脑为元神之府”，神庭穴是脑内元神所藏之处，而本神为诸神之本是足少阳胆经脉气所发。同时，大脑额叶是情感智力所在区域，三穴均位于大脑额叶表面的头皮层。在现代针灸临床中“智三针”被广泛应用，治疗与“脑”相关的精神神志类疾病有明显效果[6]，而电针可以根据频率、电压和持续时间来进行标准化[7]。课题组既往的研究表明，电针“智三针”可使VaD模型大鼠相关的脑组织产生积极变化[8]，但其治疗VaD的神经生物学机制不明。

尼莫地平作为钙拮抗剂，可用于缺血性脑血管病治疗[9]。其作用于血管平滑肌，抑制脑缺血细胞去极化时K+外流，解除Ca2+内流引起的平滑肌细胞收缩和血管痉挛，改善脑缺血缺氧，并增加脑血流量，同时抑制动脉平滑肌细胞内磷酸二酯酶的活性，使细胞内cAMP浓度增高，达到松弛动脉平滑肌，扩张全身小动脉，改善脑循环，发挥脑保护的作用[10]。

在神经系统功能中，突触与突触传递的关系十分密切，同时突触结构的可塑性也是学习记忆的神经生物学基础[11]。突触连接可以完成神经元对信号的接收与处理功能，而神经系统的可塑性在很大程度上由突触在形态结构数量及功能状态调节方面决定[12]。

Psd-95属于Psd核心构架蛋白，位于突触后膜上，是神经细胞骨架蛋白的一种，既参与细胞内信号转导，又能调节离子通道与突触活性[13]。Psd-95可以通过其自身不同的结构域与NMDR受体、钾离子通道、细胞黏附因子、细胞质蛋白相互结合，形成突触相关的信号复合物，并将其传输至突触后细胞[14-15]，因而在调控神经元突触可塑性与维持突触后膜结构的稳定中起着十分重要的作用。Syp是一种特殊的广泛存在于神经元突触前膜中的蛋白，是突触可塑性的特异性标志性分子物[16]。研究显示，Syp与突触重建和神经元再生相关[17]，其调节突触可塑性的方式通过影响突触结构和神经递质的释放来实现，并参与Ca2+依赖神经递质释放和囊泡运输，而蛋白的表达量间接地反映了突触结构的完整性和功能状态[18]。刘斌等[19]发现脑缺血损伤后的大鼠海马区突触密度降低，突触连接减少，Syp表达量下降。因此，Syp可以间接反映突触形成和重塑的程度[20]。两种突触相关蛋白在突触连接中起到了“桥”的作用，因此，Psd-95和Syp两种蛋白含量的检测可大致预估突触发生、突触数量，反映突触的传递功能，是体现突触可塑性的重要标志。

本研究在针灸学基本理论的指导下，采取电针“智三针”进行治疗，观察不同组别大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期和穿越平台期的时间及海马CA1区Psd-95和Syp的阳性细胞量与蛋白表达量，实验结果表明，经过电针“智三针”的治疗的大鼠逃避潜伏期时间缩短，跨越平台次数增加，提示学习记忆能力具有显著改善。海马CA1区是反映大脑缺血缺氧最为敏感的部位之一，并且Psd-95和Syp是中枢神经系统突触前后的特殊分子标志物，总体趋势上看，电针智三针组海马CA1区Psd-95和Syp的阳性细胞量与蛋白表达量有不同程度的升高，其机制之一可能与电针“智三针”促进海马CA1区突触相关蛋白Psd-95和Syp的表达，改善突触可塑性高度相关。但目前缺乏其他科学研究对照，考虑与样本量小有关，下一步将继续研究突触相关蛋白在脑缺血损伤后的不同时间点的表达及智三针调节脑缺血后突触可塑性的具体机制，为临床提供一定的实验依据。