象皮生肌膏促糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合机 制 研 究*

高兰天，周忠志

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

糖尿病足（diabetic foot，DF）是因神经病变而失去感觉和因缺血而失去活力，合并感染而引起的足溃疡，是糖尿病常见慢性并发症之一[1]。糖尿病足发生后创面难以愈合，甚至进一步恶化，有截肢的风险，严重地影响了患者的生活质量[2]。国外流行病学资料表明，在所有非外伤性低位截肢手术中，糖尿病患者占40%～60%[3]；在糖尿病相关的低位远端截肢中，有85%发生在足部溃疡后[4]。糖尿病足溃疡创面能否有效处理对疾病的转归非常重要。目前对糖尿病足创面的处理尚无十分有效而统一的标准，而中医药外用制剂在此方面表现出一定的优势。我院根据中医药外治法及其遣方组成的象皮生肌膏具有祛腐生肌，活血止痛的功效，治疗糖尿病足溃疡收效良好[5]。本研究将象皮生肌膏用于糖尿病皮肤溃疡大鼠，通过观察创面组织切片、检测相关指标和评价创面愈合情况，初步探讨象皮生肌膏促糖尿病溃疡愈合的疗效及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物8周龄SPF级健康SD雄性大鼠36只，体质量250～300 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2009-0004。均饲养于湖南中医药大学动物实验中心，饲养环境为SPF级，温度维持在20～25℃，动物分笼饲养，饲以标准饲料，自由饮水，隔日更换垫料、消毒笼具。所有的大鼠饲养与操作均经过湖南省实验动物管理委员会批准。

1.2 药物与试剂 象皮生肌膏药物组成：象皮粉120 g、当归100 g、生地黄120 g、血余炭80 g、炉甘石200 g、生石膏150 g、龟甲120 g，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科自制（批号：20190818）；链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司，批号：SZ0120）；柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（天津百伦斯生物技术有限公司，批号：PH1716）；水合氯醛（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：191S09R23)；酶联免疫吸附测定试剂盒（上海恒远生物科技有限公司，批号：CK5441Y）；ELIVISON试剂盒（PV-9000，批号：FO206-546U）和DAB酶底物显色试剂盒（批号：I30046）（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 主要仪器LAB VISION 2D全自动免疫组化染色仪（美国Lab Vision公司）；光学显微镜（日本CARTON公司）；Image Pro Plus 6.0图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）。

1.4 造模与分组

1.4.1 糖尿病模型的建立[6]36只SD大鼠适应性饲养1周。随机取24只大鼠给予高脂高糖饲料（饲料配置：20.0%猪油+10.0%蔗糖+2.5%胆固醇+1.0%胆酸盐+66.5%常规饲料）喂养2周，造模前大鼠禁食12～16 h，称重后临时用0.5 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH=4.5）配制1%（质体比）STZ溶液，按45 mg/kg进行腹腔注射（仅注射一次即可）。72 h后每天07:00:00监测血糖，若连续3次血糖浓度均＞16.7 mmo1/L，即视为糖尿病模型造模成功。其余12只大鼠腹腔一次性注射等体积不含STZ的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

1.4.2 动物分组 造模成功后的24只糖尿病大鼠随机分为模型组（12只）、治疗组（12只）。12只未造模大鼠为正常组。

1.4.3 皮肤损伤模型的建立[7]观察14 d后将所有大鼠建立皮肤损伤模型。腹腔注射适量4%水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉大鼠，将其背部毛发使用电推工具剪短后，再涂抹6%硫酸钠溶液用来除掉毛发，毛发溶解后迅速使用清水冲洗；消毒大鼠背部皮肤在大鼠脊柱正中肩胛骨下缘水平线下2 cm切除一块2cm×2cm全层皮肤，可见深筋膜存在。

1.5 实验给药 各组大鼠造模后次日开始药物干预，治疗组生理盐水清洗溃疡部位后，象皮生肌膏外敷并用医用纱布覆盖固定；模型组和正常组仅用生理盐水清洗溃疡部位后医用纱布覆盖固定。每隔24 h予以创面换药处理，每2 d监测一次血糖。

1.6 观察指标 药物干预第14天时观察大鼠溃疡创面，麻醉后切取创面周围1 cm组织，观察组织病理学、免疫组化、VEGF指标。药物干预第21天，将大鼠脱颈椎法处死后切取创面周围1 cm组织，检测各组VEGF含量。

1.6.1 病理学检查 切取的标本10%甲醛固定，HE染色，石蜡包埋切片。HE染色：将切片苏木精液染色5 min，水洗5 min，1%的盐酸乙醇分化30 s，水洗20 s，蒸馏水过洗10 s。入伊红液中染色2 min，蒸馏水过洗10 s。再将切片依次放入95%乙醇（Ⅰ）1 min、95%乙醇（Ⅱ）1 min、无水乙醇（Ⅰ）3 min、无水乙醇（Ⅱ）3 min、二甲苯（Ⅰ）5 min、二甲苯（Ⅱ）5 min中脱水透明，中性树胶封片。光学显微镜观察组织病理学改变情况。

1.6.2 免疫组织化学 常规石蜡包埋切片，采用LAB VISION 2D全自动免疫组化染色仪，EnVision二步法染色，光学显微镜下观察新生血管情况。

1.6.3 酶联免疫吸附反应 将切取的标本充分研碎制备匀浆，以2 000 r/min速度离心10 min，吸取上清液，采用ELISA法测定组织中VEGF含量，严格按照说明书方法操作。

1.6.4 创面愈合肉眼观察 观察并记录3组大鼠药物干预后3、7、14、21 d创面愈合情况。创面愈合时间，即创面模型建立至创面完全上皮化、闭合的时间。数码相机照相后，采用Image Pro Plus 6.0图像分析系统测量创面面积，按以下公式计算创面闭合率。创面闭合率=（创面初始面积-创面形成后第n天的面积）/创面初始面积×100%。

1.7 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件进行分析，计量资料采用“均数±标准差”（±s）表示，3组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK q检验，不同时间点的比较采用重复测量方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠成模情况 糖尿病皮肤溃疡大鼠造模24只，一次成功造模24只，造模成功率100%。造模成功后大鼠随机血糖＞16.7 mmoL/L，疲乏，消瘦，活动下降，毛发干枯、稀疏，多饮多尿。

2.2 各组大鼠皮肤溃疡组织病理观察 药物干预第14天时，正常组大鼠皮肤表皮层细胞排列整齐，颗粒层清晰可见，真皮层及皮肤附件结构、形态良好；模型组大鼠表皮细胞有变性改变，细胞结构不清，核浓缩，表皮和表皮下层结构松散；治疗组大鼠表皮细胞排列基本整齐，颗粒层可见，真皮层及皮肤附件结构清晰。（见图1）

图1 各组大鼠皮肤溃疡组织HE染色图（×400）

2.3 各组大鼠皮肤溃疡组织免疫组织化学染色观察 药物干预第14天时，正常组大鼠皮肤溃疡组织结构清晰，有较多具有成熟管腔结构的新生血管形成；模型组大鼠皮肤溃疡组织结构松散，细胞变性，新生血管较少且细小；治疗组大鼠皮肤溃疡组织结构基本清晰，具有成熟管腔结构的新生血管较粗，清晰可见。（见图2）

图2 各组大鼠皮肤溃疡组织免疫组化染色图（×400）

2.4 各组大鼠皮肤溃疡组织VEGF表达情况 治疗组和模型组大鼠干预后14、21 d皮肤溃疡组织VEGF含量低于正常组（P＜0.05）。治疗组干预后14、21 d皮肤溃疡组织VEGF均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠皮肤溃疡组织VEGF含量比较（±s，μg/g）

表1 各组大鼠皮肤溃疡组织VEGF含量比较（±s，μg/g）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只） 第14天 第21天正常组 12 49.43±4.44 45.83±3.56模型组 12 14.94±2.40a 11.07±2.62a治疗组 12 38.51±4.41a b 20.14±3.37a b F 148.08 271.56 P 0.00 0.00

2.5 各组大鼠皮肤溃疡创面愈合情况 正常组大鼠干预后3 d创面缩小，有肉芽组织长出；干预后7 d创面明显缩小，肉芽组织新鲜，血运良好；干预后14 d创面趋于闭合，干预后21 d创面完全闭合。模型组大鼠干预后出现创面扩大，肉芽组织生长缓慢，色暗，创面渗出明显，愈合缓慢。治疗组药物干预后亦出现创面扩大，但3 d后创面开始缩小，肉芽组织生长得到改善，创面闭合加快，但未达正常组水平。3组大鼠创面闭合率比较，治疗组和模型组大鼠干预后3、7、14、21 d创面闭合率均低于正常组（P＜0.05）；治疗组干预3 d时与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），干预后第7、14、21天创面闭合率明显高于模型组（P＜0.05）。（见表2、图3）

表2 各组大鼠皮肤溃疡创面闭合率比较（±s，%）

表2 各组大鼠皮肤溃疡创面闭合率比较（±s，%）

注：F时间主效应=1 877.80，P时间主效应=0.00；F分组主效应=54.48，P分组主效应=0.00；F交互效应=32.51，P交互效应=0.00；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只） 3 d 7 d 14 d 21 d F P正常组 12 12.92±4.28 56.02±7.68 -1.56±2.04a 13.67±3.12a 90.04±4.15 100.00±0.00 36.25 0.00模型组 12 40.84±5.42a 60.90±6.23a 19.17 0.00治疗组 12 4.23±2.25a 31.42±4.50ab 65.02±5.61ab 81.49±5.73ab 17.08 0.00 F 16.98 45.75 69.77 48.06 P 0.00 0.00 0.00 0.00

图3 各组大鼠皮肤溃疡创面闭合率交互效应轮廓图

3 讨 论

随着人类生活习惯和作息规律的改变，代谢性疾病日趋增多，也越来越受到国内外学者的关注。糖尿病是代谢性疾病中较为常见的一种，常导致全身性病变，以血管和神经病变尤甚[8]。其中糖尿病皮肤溃疡是糖尿病中最严重的并发症之一，具有较高的致残率和死亡率[9]。糖尿病患者大血管及小血管由于长期处于高糖环境，导致血管内皮受损，大血管管腔变窄，远端供血不足；小血管瘀滞，微循环障碍，加重组织缺血缺氧，导致创面无法得到有效而及时的修复[10]。其特点为愈合能力低下，愈合延迟，甚至不愈合。创面修复不仅依赖于上皮细胞和成纤维细胞增殖分化，爬行覆盖创面，还依赖于内皮细胞增殖分化后形成新生血管[11]。研究显示，高糖环境将导致内皮祖细胞和内皮细胞功能受损，导致损伤血管不能得到修复，创伤后新生血管难以形成，故创面不能得到修复[12]。

我院药物制剂中心生产的象皮生肌膏是在张山雷《疡科纲要》记载的象皮生肌膏原方基础上对其药物配伍及药量进一步化裁，结合现代制膏工艺加以改进而制成[13]。象皮生肌膏属生肌类中药制剂，其药物组成包括象皮粉、当归、生地黄、血余炭、炉甘石、生石膏、龟甲。其中象皮粉具有敛疮止血的功效；当归具有补血活血、消肿排脓、止痛生肌的功效；生地黄具有清热凉血、生津滋阴的功效；血余炭具有消瘀止血的功效；炉甘石具有解毒收湿、止痒敛疮的功效；生石膏具有清热解毒泻火的功效；龟甲具有滋阴潜阳、壮骨养血的功效。诸药合用具有清热活血、散瘀止痛、敛疮生肌的作用，既根除外在病灶之标，又兼顾充实其本，以调节体内气血阴阳，达祛腐敛疮生肌的目的。目前象皮生肌膏在慢性皮肤溃疡、植皮/皮瓣术后残余创面、糖尿病足、外伤性皮肤缺损、肛瘘术后创面换药时疗效确切[14]。象皮生肌膏属纯中药制剂有无疼痛、无刺激、无腐蚀特点，具有较强的祛腐生肌长皮的作用。前期临床研究发现，象皮生肌膏用于糖尿病足换药能明显改善创面血运，促进创面愈合[5]。

创面修复的速率与新生血管长入的速率呈正相关，因新生血管能提供修复所需要的营养成分和氧，从而促进上皮细胞和成纤维细胞增殖分化[15]。本实验在糖尿病大鼠背部皮肤制备皮肤缺损溃疡模型，表现为创面正常组织结构破坏、排列紊乱，符合糖尿病慢性创面的组织病理学特征。临床治疗中改善糖尿病皮肤溃疡创面的血运是治疗关键，创面组织细胞供血供氧得到保证，方能发挥其正常的增殖分化功能。从本实验中HE染色结果可见治疗组中象皮生肌膏通过改善糖尿病皮肤溃疡创面的供血供氧，使得创面中凋亡和变性的细胞减少，细胞的组织形态接近正常组。处于高糖环境下受损的组织细胞的形态能恢复接近正常，才能使其发挥正常的生理功能。治疗组大鼠在第14天和第21天VEGF含量明显高于模型组，且第14天时治疗组大鼠新生的血管明显多于模型组，可见象皮生肌膏能明显促进内皮细胞分泌VEGF，从而加速血管的新生。VEGF是参与血管化调控的主要生长因子，可触发一系列修复反应，能有效促进血管内皮细胞增殖及迁移，促进新血管形成，糖尿病难愈创面VEGF不仅呈低水平表达，表达高峰持续时间也缩短，是创面难愈的重要原因之一[16]。郭志良等[17]研究表明，白藜芦醇等能激活受高糖损伤的大鼠内皮祖细胞，改善其生物学功能以发挥促进血管新生的作用。本研究中治疗组大鼠VEGF表达明显高于模型组，新生血管增多，可能与象皮生肌膏改善了内皮祖细胞和内皮细胞的生物学功能有关。治疗组大鼠第7、14、21天创面闭合率均明显高于模型组，可见象皮生肌膏通过促进糖尿病皮肤溃疡创面血管的生成而加速了创面愈合。我们认为，象皮生肌膏可通过促进血管形成，改善局部血运，促使细胞增殖，加速肉芽组织生成和上皮化，从而促进糖尿病皮肤溃疡创面愈合。本实验为初期实验研究，主要进行了组织学观察，具体作用机制尚需进一步研究。