基于血热证探讨银屑病病证结合动物模型的构建*

杨大伟，贾 颖，张皎皎

（山西中医药大学，山西 晋中 030619）

银屑病（psoriasis）是一种以红斑、鳞屑损害为主的慢性炎症性皮肤病。西医对银屑病的病因认识尚不明确，临床治疗有限，而中医通过辨证论治，对证治疗，使银屑病逐渐成为中医治疗的优势病种。临床研究与科学研究是相辅相成的，已知的银屑病动物模型，单纯以模拟病理特征为目的，广泛存在造模时间长、皮损不典型、持续时间短、技术要求高等问题[1]。病证结合动物模型的建立一定程度上改善了先前模型存在的问题。它将西医疾病模型和中医证候因素相结合，即西医疾病+中医病因，模型兼顾西医的病理特征和中医的证候表现，更加符合临床实际情况[2]。现国内文献报道银屑病病证结合动物模型有血瘀证[3]、脾虚证[4]、湿热证[5]，尚无血热证相关研究。故本实验立足于血热证，以中医病因学说为指导，采用复合多因素方法探讨银屑病血热证大鼠模型的建立，并尝试对模型进行评价。

1 材料与方法

1.1 实验动物6～8周龄雄性SPF级SD大鼠30只，体质量230～250 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（沪）2018-0006。用代谢笼单只适应性饲养1周，室温（23±2）℃，湿度55%～65%，12 h光照/黑夜循环，自由饮水、饮食。医学实验动物处理遵循实验动物管理和使用的规定。

1.2 药物与试剂 盐酸普萘洛尔（商品名：心得安，上海贤鼎生物科技有限公司，CAS号：318-98-9）；乳剂基质（广州市欧妍化妆品有限公司）；干姜、炙甘草（山西维康堂中药饮片有限公司）；大鼠血清T3试剂盒（上海泛柯实业有限公司，批号：F3512-A）；大鼠血清T4试剂盒（上海泛柯实业有限公司，批号：F3458-A）；大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（上海泛柯实业有限公司，批号：F3056-A）；大鼠白介素-17（IL-17）试剂盒（上海泛柯实业有限公司，批号：F2964-A）。干姜和炙甘草临床每人每天用最大剂量为20 g/60 kg[6]，按人与动物体积表面积折算的等效剂量比值进行换算，配置成浓度1 g/mL煎煮液备用；将5 g的普萘洛尔加入95 g的乳剂基质，均匀搅拌，配成5%的心得安乳剂备用。

1.3 主要仪器JCS-11001C型天平（哈尔滨众汇衡器有限公司）；体温计（山西吉泰和宁科技有限公司）；紫外线光疗仪（天津市合普科技有限公司）；H5501型光学显微照相系统（日本尼康株式会社）；病理切片机（湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司）；LeicaEG1150H型石蜡包埋机（德国Leica公司）；SM600型酶标仪（上海永创医疗器械有限公司）。

1.4 分组与造模 采用随机数字表将30只SD大鼠分为空白组、银屑病组、银屑病血热证组，每组10只。空白组大鼠正常进食、进水。银屑病组大鼠用电子推在大鼠背部剪出2 cm×2 cm的无毛区，将5%心得安乳剂按照0.3 g/cm2均匀涂抹，厚度约为1.0 mm，3次/d，共21 d[7-8]。银屑病血热证组仿照银屑病组，在大鼠无毛区涂抹5%心得安乳剂，同时自抹药之日起，灌服干姜、甘草煎煮液，剂量为1 mL/100 g，1次/d，共21 d。另外将银屑病血热证组大鼠置于固定器中，放置紫外灯光疗仪灯具下方，垂直距离30 cm，1次/d，1 h/次，共21 d[9]。

1.5 观察指标

1.5.1 中医血热证症状的观察 参照《中医诊断学》[10]血热证标准，大鼠出现急躁好斗、口干多饮、纳呆食少、小便少而黄、大便少而硬等表现属于血热证的基本要求。具体指标有大鼠每日的进食量、饮水量、排便量和性状、排尿量和性状，以及造模前后的体质量和肛温的变化。

1.5.2 背部皮肤皮损形态观察 肉眼观察大鼠背部皮肤有无红斑、鳞屑多少、浸润肥厚的情况。

1.5.3 背部皮肤组织病理学观察 采用腹腔注射10%的水合氯醛（0.4 mL/100 g）进行麻醉，3 min后腹主动脉采血8～10 mL，离心后取上清备用。脊柱脱臼法处死大鼠，迅速剪取大鼠背部皮肤，置于4%多聚甲醛溶液固定，后进行石蜡包埋，切片，常规HE染色，光镜下逐一观察背部皮肤的病理变化。参照Baker法[11]进行组织病理评分。

1.5.4 大鼠T3、T4及炎症细胞因子的检测 采用ELISA法严格按照试剂盒操作检测大鼠血清三碘甲状腺氨酸（T3）、四碘甲状腺氨酸（T4）及炎症因子TNF-α、IL-17的表达水平。

1.6 统计学方法 所有数据均采用SPSS 25.0统计软件进行分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠背部皮肤皮损形态观察 空白组大鼠毛发正常有光泽，无异常活动表现；银屑病组大鼠毛发杂乱晦暗，常回首搔抓皮损，表面覆盖鳞屑，有少量的红斑和丘疹；银屑病血热证组大鼠毛发杂乱，频频回首搔抓皮损，表面覆盖大量鳞屑，鳞屑掉落有出血现象，有明显的红斑和丘疹，表皮肥厚。（见图1）

图1 各组大鼠背部皮肤形态观察

2.2 各组大鼠背部皮肤组织病理学观察 空白组大鼠皮肤结构完整，表皮与真皮界限清楚，角质层薄，颗粒层明显，棘层肥厚；银屑病组和银屑病血热证组大鼠表皮明显增厚，可见不同程度的过度角化，角化中可见Munro微脓肿形成，棘层肥厚，颗粒层变薄，真皮浅层血管扩张充血水肿伴炎细胞浸润。银屑病血热证组和银屑病组大鼠Baker评分均高于空白组（P＜0.01）；银屑病血热证组大鼠Baker评分高于银屑病组（P＜0.05）。（见图2、表1）

表1 各组大鼠造模后Baker评分比较（±s，分）

表1 各组大鼠造模后Baker评分比较（±s，分）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与银屑病组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只） Baker评分空白组 10 1.23±0.45银屑病组 10 5.36±0.67a银屑病血热证组 10 6.19±0.54a b

图2 各组大鼠背部皮肤组织病理切片图（HE，×40）

2.3 各组大鼠中医血热证症状观察 银屑病血热证组大鼠造模后出现进食量减少，饮水量增多，排便量减少且颜色为亮黄色，排便量减少且干硬，体质量减轻、肛温升高等明显的血热证表现，与空白组和银屑病组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。与空白组比较，银屑病组大鼠进食量减少，饮水量增多（P＜0.05），但排便量和排尿量与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表2～4）

表2 各组大鼠造模前后体质量比较（±s，g）

表2 各组大鼠造模前后体质量比较（±s，g）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与银屑病组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只） 造模前 造模后 差值空白组 10 264.7±5.74 317.70±7.70 53.00±8.34银屑病组 10 263.2±5.39 239.60±4.67-23.60±6.40a银屑病血热证组10 265.7±6.40 228.00±4.27-37.70±5.70a b

表3 各组大鼠造模前后肛温比较（±s，℃）

表3 各组大鼠造模前后肛温比较（±s，℃）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与银屑病组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只） 造模前 造模后 差值空白组 10 37.99±0.14 38.12±0.15 0.13±0.25银屑病组 10 38.13±0.13 38.48±0.14 0.35±0.23a银屑病血热证组 10 38.05±0.14 39.19±0.15 1.14±0.24a b

表4 各组大鼠造模后进食量、饮水量、排便量、排尿量比较（±s）

表4 各组大鼠造模后进食量、饮水量、排便量、排尿量比较（±s）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与银屑病组比较，bP＜0.05

粪便 尿液排便量(g) 性状 排尿量(mL)性状空白组 10 18.72±1.10 26.21±1.49 10.76±1.48湿润11.83±0.90淡黄银屑病组 10 16.80±0.65a 29.21±1.48a 9.44±0.49干小10.54±0.45米黄银屑病血热证组10 15.50±0.78ab 32.42±3.06ab 8.61±0.63ab干硬8.97±0.96ab亮黄组别 动物数(只)进食量(g) 饮水量(mL)

2.4 各组大鼠T3、T4及炎症细胞因子水平测定 银屑病血热证组和银屑病组大鼠T3、T4、TNF-α、IL-17水平均高于空白组（P＜0.01），银屑病血热证组大鼠T3、T4、TNF-α、IL-17水平高于银屑病组（P＜0.05）。（见表5）

表5 各组大鼠血清T3、T4、TNF-α、IL-17水平比较（±s，pg/mL）

表5 各组大鼠血清T3、T4、TNF-α、IL-17水平比较（±s，pg/mL）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与银屑病组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只） T3 T4 TNF-α IL-17空白组 10 0.96±0.17 36.82±6.76 1.34±0.18 0.97±0.18银屑病组 10 1.68±0.43a 44.10±3.41a 1.85±0.64a 1.62±0.33a银屑病血热证组10 2.09±0.75ab 58.21±9.62ab 2.23±0.43ab 2.56±0.65ab

3 讨 论

临床研究发现，银屑病与体质存在相关性，血热证集中在阴虚体质[12]。基于此，我们参考并比较了其他实验研究[13-14]，选择体质偏于虚热的雄性SD大鼠作为实验动物。

银屑病血热证的形成无外乎“外因”和“内因”的影响，外受于风热毒邪，内嗜食辛辣炙煿致使脾胃积热，内外邪热交争，蕴结肌表伤津耗血。故本研究造模方式遵循并模拟银屑病血热证的发病规律，即外涂抹心得安乳剂和照射紫外线灯，内灌服干姜、甘草煎煮液。心得安乳剂属于中医“药毒”范畴，中医辨证多从风热论治[15]。故本研究借鉴了黄畋等[7]的研究及GAYLARDE P M等[8]的研究中用普萘洛尔诱导豚鼠银屑病的造模方法。其次，用紫外线灯照射肌表以模拟日光。日光属于中医的暑热之邪，《素问·生气通天论篇》指出，伤于暑热则“汗出”，“体若燔炭”。《素问·至真要大论篇》言：“辛甘发散为阳”，干姜为大辛大热之品，炙甘草为甘滋之物，持续灌服煎煮液使脾胃积热耗气伤阴，致使火热内生，从而奠定内伤的基础。

《素问·疟论篇》言：“阳盛则外热，阴虚则内热”，外感风热毒邪直接作用肌表，内受火热耗损阴津，外感和内伤的双重刺激，导致大鼠皮肤不仅显现红斑、丘疹、鳞屑等银屑病样皮损，还表现出口渴喜饮、溲黄便秘、进食减少、体质量减少、肛温升高、局部皮肤温度升高等与临床血热证相符的症状。其次，IL-17是炎症细胞因子，具有极强的致炎性，是银屑病特异性指标的微观表达，与TNF-α存在相互作用，能够扩大并维持炎症反应。临床研究发现IL-17和TNF-α在银屑病皮损中的表达均高于正常组和对照组[16]。故本研究检测大鼠血清IL-17和TNF-α的表达，得到了与临床一致的结果，由此证明银屑病大鼠模型的建立。魏歆然等[17]实验研究结果表明寒证、热证的主要生理病理基础在于内分泌激素水平的高低，热证模型组的T3、T4、TNF-α均高于正常组和寒证模型组。故本研究检测大鼠血清中T3、T4和TNF-α的表达，结论与魏歆然的一致，由此证明银屑病血热证大鼠模型的建立。

证是中医学特有的概念，证的存在或消除决定了疾病是痊愈还是转变。因此，本研究有效地把病与证结合，成功地将血热证形成因素运用到动物模型，构建的模型不仅稳定性高，符合银屑病慢性炎症的特点，而且贴近临床，既具有西医的病理改变又具有中医的特定症状。但银屑病发病涉及多种复杂因素，本研究仅仅是对银屑病病证结合动物模型的初步摸索，如何精准选取造模因素和如何完善评价标准是我们下一步探索的方向。