清肝益肾祛风复方对高血压肠道菌群失调的干预效应研究

唐晓婷，熊敏琪，2，崔金刚，2，王培伟，2，杜霄烨，2，陈 瑜，2，张 腾，2

(1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437；2.上海市中医药研究院中西医结合临床研究所，上海 200437)

肠道是人体最大的内分泌神经激素网络，肠道菌群在维持机体内环境平衡中发挥着关键作用。肠道菌群参与许多必要和有益的生理过程，如大量营养物质的消化和一些维生素的合成，微生物群落结构和功能发生变化与多种疾病状态相关[1]。目前研究表明肠道菌群失调与高血压密切相关，这是因为肠道菌群与内分泌系统、神经系统和免疫系统进行通信，以调节宿主体内平衡，包括血压[2-3]。肠道菌群失调还可以诱发全身炎症反应[4]，而轻度的慢性炎症可以促进高血压的发展[5-6]。菌群代谢产物如短链脂肪酸能介导与宿主的相互作用，可以影响肠道健康以及免疫系统、血管系统和心脏[7]。本课题组前期临床观察结果表明，清肝益肾祛风复方可以显著降低高血压前期患者收缩压及舒张压，在显著改善24 h动态血压相关参数的同时，还可以有效降低患者的收缩压负荷及舒张压负荷[8]。前期动物实验研究结果也表明，清肝益肾祛风复方具有显著的降压效果，对高血压相关肠道屏障功能失调具有干预效应[9-10]。因此本实验以肠道菌群为切入点，研究清肝益肾祛风复方对高血压状态下肠道菌群失调的干预作用，旨在为清肝益肾祛风复方干预高血压及高血压相关病理过程的效应机制提供新的实验依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 4周龄WKY雄性大鼠6只、自发性高血压(SHR)雄性大鼠12只，均为SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001。饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物实验中心，饲养室温度(23±2)℃，湿度40%～70%，光照周期为12 h光照/12 h黑夜，自由进水、进食。

1.2药物与试剂 清肝益肾祛风复方由川芎15 g、益母草30 g、桑寄生15 g、柴胡15 g、黄连6 g、川牛膝15 g、羌活15 g、防风15 g、黄精15 g、炒黄芩15 g、石决明30 g、夏枯草30 g组成，各药材购于上海康桥中药饮片有限公司，常规煎煮。QIAamp粪便DNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司。

1.3主要仪器 Agilent6890N 气相色谱仪 HP-INNOWax，美国Agilent公司生产；PCR定量测试仪(Mastercycler pro)，德国Eppendorf 公司生产。

1.4动物分组与干预 所有实验动物用普通饲料适应性喂养1周后，先将动物按体重由大到小依次编号，然后从随机数字表上抄录随机数字，用完全随机方法将SHR大鼠分为模型组、清肝益肾祛风复方组各6只，将6只同周龄WKY雄性大鼠设为正常组。清肝益肾祛风复方给药剂量按照人体剂量的6.3倍换算(川芎1.35 g/kg、1.35 g/kg、黄连0.54 g/kg、羌活1.35 g/kg、防风1.35 g/kg、夏枯草2.70 g/kg、川牛膝1.35 g/kg、黄精1.35 g/kg、石决明2.70 g/kg、炒黄芩1.35 g/kg、桑寄生1.35 g/kg、益母草2.70 g/kg)制备浓缩液。从6周龄开始，清肝益肾祛风复方组给予清肝益肾祛风复方浓缩液2 mL灌胃，正常组和模型组给予等体积纯净水灌胃，均1次/d，持续至20周龄。

1.5检测指标及方法

1.5.1粪便16s rDNA测序 20周龄时，将各组大鼠置于代谢笼中12 h，次日采集粪便，存放于-80 ℃冰箱，粪便进行DNA抽提，运送至上海伯豪生物医药科技有限公司进行16s rDNA测序，观察粪便中菌群多样性和丰度变化，其中Chao和Ace指数用于计算菌群丰度，Simpson和Shannon指数用于计算菌群多样性。

1.5.2粪便短链脂肪酸检测 取大鼠粪便2.0 g，放置于15 mL的离心管中，用10 mL纯水溶解，振荡2 min，用大于10 000 r/min的转速离心，过滤(0.45 μm)后装入15 mL离心管内。取2 mL制备好的样品，放置于15 mL离心管中，加入0.2 mL硫酸溶液(浓度50%)，再加入2.0 mL乙醚，振荡30次后离心，转速大于10 000 r/min离心5 min，置4 ℃冰箱内放置30 min，取上层乙醚溶液进行气相色谱分析。采用HP-INNOWax 弹性石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；色谱柱温度程序：100 ℃(1 min)5 ℃/min→150 ℃(5 min)；载气：高纯氮气，纯度≥99.999%；载气流速2 mL/min；进样口温度270 ℃；无分流进样，进样量2.0 μL；检测器温度(FID)280 ℃，检测乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸水平。

2 结 果

2.1各组大鼠肠道菌群多样性及丰度比较 模型组的Ace指数、Chao指数、Shannon指数均显著低于正常组(P均<0.05)；清肝益肾祛风复方组Ace指数、Chao指数、Shannon指数均显著高于模型组(P均<0.05)，Simpson指数显著低于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 正常组和自发性高血压各组大鼠粪便16s rDNA测序Ace、Chao、Shannon、Simpson指数比较

2.2各组大鼠肠道菌群结构及相对丰度比较 基于Unifrac的PCoA分析显示，无论是考虑序列丰度的基于权重的方法(Weighted Unifrac)还是不考虑序列丰度的方法(Unweighted Unifrac)，均显示3组的菌群结构出现了一定的差异性，见图1及图2。模型组的变形菌门及变形菌纲相对丰度均显著高于正常组(P均<0.05)，双歧杆菌目及双歧杆菌属相对丰度均显著低于正常组(P均<0.05)；清肝益肾祛风复方组变形菌门及变形菌纲相对丰度均显著低于模型组(P均<0.05)，双歧杆菌目及双歧杆菌属相对丰度均显著高于模型组(P均<0.05)，见图3。

图1 正常组和自发性高血压各组大鼠大鼠肠道菌群考虑序列丰度的基于权重的Weighted Unifrac PCoA分析

图2 正常组和自发性高血压各组大鼠大鼠肠道菌群不考虑序列丰度的Unweighted Unifrac PCoA分析

图3 正常组和自发性高血压各组大鼠肠道菌群的相对丰度比较

2.3各组大鼠粪便短链脂肪酸水平比较 模型组大鼠粪便中乙酸、丙酸、异丁酸相对水平均显著低于正常组(P均<0.05)，丁酸、戊酸、异戊酸相对水平与正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；清肝益肾祛风复方组大鼠粪便中乙酸、丁酸相对水平均显著高于模型组(P均<0.05),丙酸、异丁酸、戊酸、异戊酸相对水平与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图4。

图4 正常组和自发性高血压各组大鼠粪便中短链脂肪酸相对水平比较

3 讨 论

肠道微生物群的平衡是维持肠道免疫和体内平衡的关键，这种平衡的破坏可能引起严重的后果。一项对41个健康人群、56个高血压前期受试者和99个原发性高血压个体进行的全面宏基因组和代谢组学分析发现：在高血压前期和高血压人群中，肠道微生物丰富度和多样性显著降低[11]。多项临床研究也表明血压升高与肠道菌群多样性降低有关[12-13]。本实验研究结果显示，模型组大鼠粪便中Ace指数、Chao指数和Shannon指数均显著低于正常组，说明高血压大鼠肠道细菌的丰富度和均匀度均降低，与既往研究结果一致；清肝益肾祛风复方组Ace指数、Chao指数和Shannon指数均显著高于模型组，说明清肝益肾祛风复方可在一定程度上改善肠道菌群的丰富度和均匀度。

肠道菌群主要由拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和疣微菌门组成，其中拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度大于90%。成熟菌群的组成主要包括拟杆菌门和厚壁菌门；若变形菌门的数量占主导地位，则标志着“不成熟”微生物群落的组成，同时也是导致肠道炎症的原因[14]。肠道菌群的不平衡也是由于变形菌门的丰度持续增加引起的[15]。有研究发现将老年小鼠的菌群移植给青年小鼠后，变形菌门等有所增加，T细胞活化，小肠发生炎症反应[16]。双歧杆菌是一种革兰阳性厌氧菌，属于放线菌门，它是第一种定植于人类胃肠道的细菌，母乳喂养的婴儿肠道中双歧杆菌的数量约占细菌总数的90%[17]。双歧杆菌作为一种益生菌，能抑制小鼠因反复使用抗生素引起的肠道炎症[18]。在体外模型中，双歧杆菌可通过抑制NF-κB和 p38 MAPK通路，保护因肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导而产生炎症反应的肠上皮细胞，同时有效恢复肠黏膜的屏障功能[19]。本研究发现，模型组大鼠粪便中变形菌门及变形菌纲相对丰度均显著高于正常组，双歧杆菌目及双歧杆菌属相对丰度均显著低于正常组；清肝益肾祛风复方组变形菌门及变形菌纲相对丰度均显著低于模型组，双歧杆菌目及双歧杆菌属相对丰度均显著高于模型组。提示高血压使肠道菌群失调，而肠道菌群组成的变化与肠屏障功能紊乱有关，清肝益肾祛风复方干预高血压的效应可能与降低变形菌丰度、升高双歧杆菌丰度，增强肠道生物屏障从而抑制炎症反应相关。

肠道微生物群释放的代谢产物对宿主的心血管健康有重要影响。短链脂肪酸是肠道内细菌代谢的最终产物，主要来自于膳食纤维。短链脂肪酸能调控肠上皮细胞增殖与凋亡的平衡，诱导肠上皮细胞分泌内源性抗菌肽，从而维持肠道内环境稳定[20-21]。短链脂肪酸主要包括乙酸、丙酸、丁酸等。丁酸是结肠上皮细胞的主要能量来源，在灌注AngⅡ的小鼠模型中，丁酸能显著改善肠道渗透性，降低血压，其与肠道屏障功能和高血压之间联系紧密[22]。体内及体外实验均证实，丙酸和丁酸可以诱导T细胞向Treg细胞分化，抑制炎症反应[23-24]。动物实验证实，对高血压小鼠补充乙酸能显著降低收缩压和舒张压，抑制心肌纤维化和左心室肥厚[25]。本实验结果显示，清肝益肾祛风复方干预能促进高血压大鼠肠道中乙酸及丁酸的产生，从而起到降压、抑制炎症反应的作用。

综上所述，清肝益肾祛风复方能下调高血压大鼠变形菌门菌群的丰度，促进肠道双歧杆菌的生长及肠道短链脂肪酸乙酸、丁酸的产生，从而改善菌群失调，维持肠道内环境稳态，进一步明确了清肝益肾祛风复方治疗高血压的机制。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。