氢氯噻嗪对大鼠血压及肾素-血管紧张素系统活性物质水平的影响

袁 静，王立立，高 洁，倪艳辉，曹广运，刘美霞

(河北省人民医院，河北 石家庄 050051)

人体血压具有典型的昼夜节律，一旦血压昼夜节律发生变化，会导致心脑血管等疾病[1-2]。肾素-血管紧张素系统(RAS)在维持机体血压昼夜节律方面发挥着重要作用，既往RAS指循环的RAS，其组分如血浆肾素活性(PRA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可调节血压及钠盐代谢[3]。近些年研究证实人体多处组织如心脏、脑、肾脏、肾上腺、血管系统等存在局部RAS，其与循环RAS不同，以独特的方式参与调节组织、器官的功能及结构[4-6]。氢氯噻嗪是常用降压药物之一，其降压效果好，价格低廉，在降压治疗中具有重要地位。但目前关于氢氯噻嗪对循环及心脏局部RAS活性物质水平的影响研究尚少，故本研究进行了相关探讨，以进一步明确其作用靶点及对机体的潜在影响。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 清洁级健康雄性Sprague-Dawlay(SD)大鼠128只，10周龄，体重250～300 g，购自北京联合利华公司，许可证号：SCXK(京)2017-0085。于河北省人民医院动物实验室、按照SPF实验动物的饲育与管理要求饲养，不限制饮食和饮水，12 h明/12 h暗。

1.2主要试剂和仪器 Trizol(华美公司)；5×buffer、AMV Reverse Transcriptase(Promega公司，鼎国生物公司分装)；4×dNTP、Rasine(MN0042 Promega公司)；Radom primer(C118A Promega公司)。鼠尾血压测定仪(RBP-1B，北京)；放免分析仪(MJNKI，美国)；紫外分光光度计(756MC，上海)；PCR 扩增仪(GeneAmp 9600，美国)；凝胶成像分析仪(UVPGDS-8000，美国)。

1.3实验方法 大鼠适应性喂养2周后随机分为对照组和实验组各64只。实验组大鼠每日给予氢氯噻嗪(天津力生制药股份有限公司，国药准字H12020166)10 mg/kg灌胃，对照组大鼠每日给予相同容积的蒸馏水灌胃，均1次/d，连续灌胃4周。

1.4检测指标及方法

1.4.1血压测定 灌胃4周后，用鼠尾测压仪测量2组大鼠的血压，取3次测量的平均值。

1.4.2血浆PRA活性及AngⅡ水平测定 测量血压后开胸暴露心脏，抽取心室内血液，留取血浆，根据放射免疫原理，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血浆PRA活性及AngⅡ水平，试剂盒均购自北京北方生物技术研究所，批内变异系数和批间变异系数分别<10%和<15%。

1.4.3血清血管紧张素转化酶(ACE)活性测定取血方法同1.4.2，留取血清，采用紫外分光光度计(λ=228)测定溶于氯化钠中的血马尿酸量含量，以此作为血清中ACE活性。试剂盒购自海军总医院，批内变异系数和批间变异系数分别<10%和<15%。

1.4.4心肌组织中AngⅡ水平测定 取血后处死大鼠，摘取心脏，迅速剥离其周围结缔组织，取一部分心肌组织进行匀浆，采用ELISA法检测心肌组织中AngⅡ水平，试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免研究所，批内变异系数和批间变异系数分别<5%和<10%。

1.4.5心肌组织中AngⅡ1型受体(AT1R mRNA)测定 采用RT-PCR法检测：取-80 ℃低温冰箱中保存的心肌组织约100 mg，加入RNA提取液(Trizol)进行匀浆，室温静置3～5 min后加入氯仿剧烈震荡并静置5～10 min，将上述匀浆液12 000 r/min离心20 min，小心吸取上清液并在其中加入等体积的异丙醇混匀，-20 ℃静置过夜。然后再将上述混匀液在4 ℃环境下12 000 r/min离心15 min，取白色RNA沉淀，用75%酒精洗涤2次混匀，4 ℃环境下12 000 r/min离心15 min后取RNA沉淀，加入20 μL去离子水获得RNA产物。鉴定后，向离心管中加入5×buffer、4×dNTP、Rnasine、Radom primer、MMV、RNA，去离子水补至25 μL，42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min，反应结束生成cDNA。向离心管中加入优化体系、引物1(AT-1引物为5’-CCAAAGTCACCTGCATCATC-3’；β-actin引物为5’-GCCATGTACGTAAGCCATCCA-3’)、引物2(AT-1引物为5’-CACAATCGCCATAATTATCCTA-3’；β-actin引物为5’-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’)、cDNA、去离子水；AT-1反应条件：预变性94 ℃ 35 s、56 ℃退火35 s、72 ℃延伸35 s，共35个循环。取20 μL PCR产物上样进行电泳分析，采用UVP凝胶成像系统进行电泳谱带分析，以特定性扩增产物AT1R电泳带峰面积积分值与β-actin电泳带峰面积积分值之比作为AT1R mRNA的相对表达量。

2 结 果

2.12组健康雄性大鼠血压及血浆PRA、AngⅡ和血清ACE活性比较 实验组大鼠血压明显低于对照组(P<0.05)，血浆PRA活性、AngⅡ水平均明显高于对照组(P均<0.05)；2组血清ACE活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组健康雄性大鼠血压及血浆PRA、血浆AngⅡ水平和血清ACE活性比较

2.22组健康雄性大鼠心肌组织中AngⅡ水平及AT1R mRNA表达量比较 2组大鼠心肌组织中AngⅡ水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，实验组大鼠心肌组织中AT1R mRNA相对表达量明显低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 2组健康雄性大鼠心肌组织中AngⅡ水平及AT1R mRNA表达量比较

3 讨 论

目前心血管病已成为重大的公共卫生问题，其中高血压是重要危险因素之一[7]。《中国高血压防治指南(2018年修订版)》[8]指出，血压水平与心血管风险呈连续、独立、直接的正相关关系，左心室肥厚、心房颤动、心力衰竭、脑卒中、终末期肾病是目前我国高血压人群最主要的并发症[8]。积极有效控制血压将有助于降低高血压患者心脑肾等靶器官损害的发生率，并可有效降低心血管疾病的病死率。

利尿剂是一类重要的降压药，临床应用已有半个多世纪，分为噻嗪型利尿剂、噻嗪类利尿剂、保钾利尿剂和襻利尿剂4大类。其中噻嗪型利尿剂如氢氯噻嗪是临床中最为常用的降压药物。Kantor等[9]调查了1999—2012年美国成人降压药物应用处方，发现噻嗪型利尿剂的应用数量仅次于ACEI类药物。且在各国最新的高血压指南中也强调了此类利尿剂在降压治疗中的地位，尤其在难治性高血压和盐敏感性高血压患者中的应用价值[10]。氢氯噻嗪应用早期通过抑制肾脏远曲小管顶端膜的Na+-Cl-转运蛋白(NCC)，抑制Na+的重吸收，通过降低容量负荷来达到降压作用。其长期降压效果是通过非利尿机制发挥作用的，可能通过作用在血管平滑肌的钙离子激活的K通道使血管扩张所致[11]，也可能是通过部分抑制血管平滑肌上的AT1R发挥作用[12]，氢氯噻嗪的非利尿降压机制中同RAS存在某种联系。本研究发现，大鼠灌服氢氯噻嗪 4周后平均血压较对照组降低约7 mmHg，说明氢氯噻嗪的降压效果是显著的。

高血压的形成机制复杂，如交感神经系统的激活、肾脏机制、血管机制、激素机制等，受多系统相互作用、相互影响。其中循环RAS在调节血压和细胞外液中起着重要作用[3]。自1898年发现肾素以来，人们对RAS的探索已经经历了一个多世纪。目前对于RAS的认识主要为两条轴线系统，这两条轴线系统所涉及的分子物质所起生物学作用是相反的。其中一条轴线为ACE-AngⅡ-AT1R轴，是经典RAS的途径。当流经肾脏的血流量减少或血钠含量降低时可刺激肾脏入球小动脉球旁细胞释放肾素，血管紧张素原(AGT)是肾素作用的唯一底物，循环肾素增加，促进AGT生成十肽的血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)，AngⅠ在限速酶ACE的作用下生成八肽的AngⅡ，AngⅡ是AGT在全身代谢产物中的重要血管活性肽，主要通过与AT1R结合导致血管收缩、水钠潴留，促进醛固酮分泌，最终促使高血压的发生。随着人们对RAS的深入研究，发现Ang家族具有复杂的衍生关系，其中ACE2/Ang(1-7)/Mas受体轴为另一条重要的轴线系统，其生理功能逐渐受到更多关注[13-14]。研究发现AngⅠ和AngⅡ均可在ACE2的作用下发生水解生成Ang(1-7)，Ang(1-7)通过与Mas受体结合产生舒张血管的作用，并具有抗血管内皮细胞及平滑肌细胞增殖、肥大、纤维化的作用，可对抗AngⅡ导致的血压升高及心室重构[15]。本研究发现，大鼠灌服氢氯噻嗪 4周后血浆PRA活性显著高于对照组，说明氢氯噻嗪可促进AngⅠ的生成，生成的AngⅠ除了促进AngⅡ生成外，对Ang家族的其他成员可能也起到促进生成作用，如Ang(1-7)的生成，因此，氢氯噻嗪有可能在降压的同时发挥血管保护及抑制心脏重塑的作用。此外，早在1978年Naftilan和Oparil两位学者就发现RAS是一种负反馈循环，AngⅡ能降低肾素基因转录或直接作用于肾小球球旁细胞抑制肾素分泌。本研究发现大鼠灌服氢氯噻嗪 4周后AngⅡ水平明显增高，提示AngⅡ水平增高对RAS可产生负反馈调节，抑制肾素的释放，从而抑制经典RAS轴的作用。另外，本研究还发现大鼠灌服氢氯噻嗪 4周后对RAS激活通路的限速酶ACE的活性无明显影响，从而可以在一定程度上抑制AngⅡ的过多生成。

RAS曾被认为是一种内分泌系统，现在被广泛认为是双系统(循环和局部/组织)或多激素系统(内分泌、旁分泌和自分泌)。除了循环RAS外，其他组织也可能完成RAS代谢过程中的某些环节，调节全身RAS水平并发挥其生理功能。研究证实，心脏局部组织具有部分RAS组分[16]，可用于调控心肌细胞的增殖、分化和重塑。心脏局部RAS的长期慢性激活，导致心肌细胞内AngⅡ的浓度增加，最终可导致心肌细胞病理性肥大和心力衰竭的发生[17]。本研究发现，AngⅡ存在于心脏组织中，但心肌组织中的浓度明显低于血清中的浓度，这说明机体自身具有一定的保护机制。大鼠灌服氢氯噻嗪4周后，心肌组织中AngⅡ水平与对照组比较无明显差异，表明长期服用氢氯噻嗪并未对心脏造成不良影响。有研究表明，在细胞水平上，AngⅡ通过与AT1R结合，激活磷脂酶C与ERK1/2通路，诱导心肌肥厚和纤维化的产生[18]。也有研究表明，AngⅡ通过与AT1R或AT2R结合，促进心脏组织内成纤维细胞外泌体的分泌，外泌体通过激活的MAPKs和Akt通路导致心脏局部肾素、AGT、AT1R和AT2R的表达增加，并下调ACE2的表达，从而促进心肌细胞肥大的发生[17]。本研究发现，心肌组织存在AT1R，大鼠灌服氢氯噻嗪 4周后，AT1R mRNA表达水平明显低于对照组，这也说明氢氯噻嗪可能对心肌细胞存在一定的保护作用。

综上所述，氢氯噻嗪能有效降低大鼠的平均血压，在一定程度上影响循环RAS，并能下调心肌组织中AT1R mRNA的表达，可能具有一定程度的心肌保护作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。