炙甘草汤对异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化大鼠心肌NF-κB信号通路的调节作用研究

白雪峰，万晓燕,惠彩霞

(延安大学附属医院，陕西 延安716000)

心肌纤维化是多种心脏疾病进展过程中心肌组织重塑的病理过程，如不及时干预则会导致心肌收缩及舒张功能障碍，进而发展为心力衰竭[1-2]。炙甘草汤最早记载于《伤寒论》，具有通阳复脉的功效，主要治疗脉结代、心动悸等。近年来现代医学研究发现，炙甘草汤可保护心肌缺血再灌注损伤后左心功能[3]，抑制扩张型心肌病患者心肌纤维化及心室重构[4]。NF-κB通路为体内重要的炎症因子相关的信号转导通路，其在心肌纤维化等疾病进展过程中扮演着重要角色[5]。本实验通过观察炙甘草汤对异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化大鼠心肌NF-κB信号通路的调节作用，旨在进一步探讨炙甘草汤的药理作用，为其临床应用提供更多依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 雄性Wistar大鼠72只，6～8月龄，体重220～240 g，购于延安大学动物实验中心，动物合格证号：SCXK(陕)2020-010。大鼠饲养于温度22～25 ℃、昼夜节律正常的清洁级动物房内。

1.2主要药物及试剂 炙甘草汤组方：炙甘草15 g、生姜10 g、桂枝10 g、人参6 g、生地黄15 g、阿胶6 g、麦冬10 g、麻仁10 g、大枣15 g，中药材饮片购自北京同仁堂股份有限公司，煎煮浓缩成生药含量为3 g/mL的汤剂；吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC，北京百奥莱博科技有限公司，货号：YT344)；异丙肾上腺素(上海禾丰制药有限公司，规格：2 mL∶1 mg，批号：201810121)；生理盐水(中国大冢制药有限公司，批号：201812031)；NF-κB p65、p-NF-κB p65兔单克隆抗体(赛默飞世尔科技公司，货号：436700和MA5-15181)；超敏ECL化学发光试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(碧云天生物技术公司，货号：P0018M和A0208)；总RNA提取试剂盒(加拿大Norgen Biotek公司，货号：17200)；实时荧光定量PCR试剂盒(北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：EM202-200T)；逆转录试剂盒(货号：AB-4366596)及PCR引物设计及合成(美国Invitrogen公司)；HE及Masson染色试剂盒(北京索莱宝科技公司，货号：G1120和G1340)。

1.3设备及仪器 Multiskan GO全波长酶标仪(赛默飞世尔科技公司)；VisualSonics小动物超声仪(上海溪拓科学仪器有限公司)；DM2500光学/荧光显微镜(德国Leica公司)；JY-1508R轮转式切片机(北京佳源兴业科技有限公司)；Gel Doc EZ凝胶成像仪系统(美国BIO-RAD公司)；CR22N高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)。

1.4实验方法 将72只健康雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、心肌纤维化组、炙甘草汤低剂量组、炙甘草汤中剂量组、炙甘草汤高剂量组及吡咯二硫氨基甲酸酯组，每组12只。除正常对照组外，其余组大鼠均参照文献[6-7]方法给予异丙肾上腺素5 mg/kg腹腔注射，1次/d，连续注射14 d后每组随机取1只大鼠进行心肌组织病理学检查，以大鼠心肌出现明显纤维化视为造模成功。证实造模成功后第2天，炙甘草汤低、中、高剂量组参考文献[8]给药剂量分别给予2 mL/kg、4 mL/kg、8 mL/kg的炙甘草汤灌胃，吡咯二硫氨基甲酸酯组参考文献[9]方法给予吡咯二硫氨基甲酸酯200 mg/kg腹腔注射，正常对照组及心肌纤维化组给予生理盐水灌胃，均1次/d，连续21 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1左心室射血分数(LVEF)、心室短轴缩短率(LVFS)的测定 末次干预24 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠后，利用小动物超声仪进行超声心动图检查，记录LVEF、LVFS。

1.5.2血流动力学的测定 超声心动图检查后，经颈动脉心室内插管，连接压力换能器，使用生物信息采集系统记录大鼠左室收缩压(LVSP)及左室舒张末压(LVEDP)。

1.5.3心肌组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白水平测定 处死各组大鼠，取部分心肌组织，根据ELISA试剂盒说明书方法测定大鼠心肌组织中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白水平。

1.5.4心肌组织病理学观察 取部分心肌组织，固定于10%中性福尔马林溶液中24 h，石蜡包埋后进行切片，厚度为5 μm，行常规HE及Masson染色，每只大鼠随机取3张切片，每张切片取5个视野，采用盲法在显微镜下观察。

1.5.5心肌组织中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平测定 取大鼠心肌组织20 mg，加入裂解液研磨裂解，提取总蛋白，取相当于50 μg蛋白的心肌组织裂解液，上样至十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上，分别经NF-κB p65、p-NF-κB p65兔单抗(1∶1 000倍稀释)在4 ℃下孵育过夜，然后在含吐温磷酸盐缓冲液中清洗30 min，经辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶2 000倍稀释)孵育后，滴加显影液，采用化学发光法使用凝胶成像仪成像，使用ImageJ 1.8.0软件对各蛋白表达水平进行量化分析。

1.5.6心肌组织中NF-κB p65 mRNA表达量测定 取大鼠心肌组织20 mg，按照说明书使用TRIzol试剂进行RNA提取，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法用于分析NF-κB p65 mRNA相对表达量。引物序列：NF-κB p65正向引物为5’-CACCACGCTCTTCTGTCTACTG-3’，反向引物为5’-GCTACGGGCTTGTCACTCG-3’；GAPDH 正向引物为5’-TCCGGTTTCCATATTACAGAAC-3’，反向引物为5’-GTGCCCTACGATATGCCCTTGC-3’。反应体系：PCR Master Mix 10 μL，正、反向引物各0.4 μL，DNA模版2 μL，加入无菌蒸馏水至20 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共计40个循环。

2 结 果

2.1各组大鼠LVEF、LVFS比较 心肌纤维化组LVEF、LVFS均显著低于正常对照组(P均<0.05)；炙甘草汤各剂量组及吡咯二硫氨基甲酸酯组LVEF、LVFS均显著高于心肌纤维化组(P均<0.05)，且LVEF、LVFS随着炙甘草汤剂量的增加而逐渐升高，炙甘草汤各剂量组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 正常对照组和心肌纤维化各组大鼠LVEF、LVFS比较

2.2各组大鼠血流动力学比较 与正常对照组比较，心肌纤维化组LVSP显著降低(P<0.05)，LVEDP显著升高(P<0.05)；与心肌纤维化组比较，炙甘草汤各剂量组及吡咯二硫氨基甲酸酯组LVSP显著升高(P均<0.05)，LVEDP显著降低(P均<0.05)，且随着炙甘草汤剂量的增加，LVSP逐渐升高，LVEDP逐渐降低，炙甘草汤各剂量组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 正常对照组和心肌纤维化各组大鼠LVSP、LVEDP比较

2.3各组大鼠心肌组织中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白水平比较 心肌纤维化组心肌组织中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白水平显著高于正常对照组(P均<0.05)；炙甘草汤各剂量组及吡咯二硫氨基甲酸酯组心肌组织中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白水平均显著低于心肌纤维化组(P均<0.05)，且TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白水平随炙甘草汤剂量的增加而逐渐降低，炙甘草汤各剂量组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3 正常对照组和心肌纤维化各组大鼠心肌组织中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白水平比较

2.4各组大鼠心肌病理学表现 正常对照组大鼠心肌组织未见明显病理学变化；心肌纤维化组大鼠出现大量不规则胶原沉积及心肌纤维化改变；炙甘草汤各剂量组及吡咯二硫氨基甲酸酯组大鼠心肌纤维化改变较心肌纤维化组轻，胶原沉积减少。见图1及图2。

图1 正常对照组和心肌纤维化各组大鼠心肌组织HE染色情况(×200)

图2 正常对照组和心肌纤维化各组大鼠心肌组织Masson染色情况(×100)

2.5各组大鼠心肌组织中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平比较 心肌纤维化组心肌组织中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65均显著高于正常对照组(P均<0.05)；炙甘草汤各剂量组及吡咯二硫氨基甲酸酯组心肌组织中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65均显著低于心肌纤维化组(P均<0.05)，且NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65随着炙甘草汤剂量的增加而逐渐降低，炙甘草汤各剂量组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3。

图3 正常对照组和心肌纤维化各组大鼠心肌组织中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达情况

2.6各组大鼠心肌组织中NF-κB p65 mRNA表达量比较 正常对照组、心肌纤维化组、炙甘草汤低剂量组、炙甘草汤中剂量组、炙甘草汤高剂量组及吡咯二硫氨基甲酸酯组大鼠心肌组织中NF-κB p65 mRNA表达量分别为1.03±0.32，7.71±0.48，6.19±0.23，4.64±0.31，1.49±0.17，1.16±0.15，心肌纤维化组显著高于正常对照组，炙甘草汤各剂量组及吡咯二硫氨基甲酸酯组均显著低于心肌纤维化组，且炙甘草汤高剂量组显著低于炙甘草汤中剂量组，炙甘草汤中剂量组显著低于炙甘草汤低剂量组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

3 讨 论

心肌纤维化是指冠状动脉粥样硬化性狭窄等原因引起的心脏长期持续性的反复缺血、缺氧等疾病因素及药物因素导致的心肌组织细胞结构及功能性病变，会引发心律失常及心力衰竭等[10]，目前尚无确切治疗方法。

炙甘草汤是治疗阴血阳气虚弱、心脉失养的经典方。随着研究的深入，发现炙甘草汤对扩张型心肌病、病毒性心肌炎及心肌缺血再灌注损伤等心脏疾病均有显著效果[11]。王庆高等[12]研究发现在常规治疗基础上加用炙甘草汤能够显著降低扩张型心肌病患者体内透明质酸、Ⅲ型前胶原、层黏连蛋白水平，进而改善患者心功能并抑制心肌纤维化的发生发展。娜几娜·吾格提等[13]研究发现炙甘草汤能够有效缩短快速起搏兔右心耳组织场电位时程，可逆转心房颤动诱导的心肌纤维化。这些研究提示炙甘草汤有治疗心肌纤维化的巨大潜力。

LVEF、LVFS、LVSP、LVEDP是临床常用的反映心功能的指标，LVEF、LVFS、LVSP降低及LVEDP升高均提示心功能降低[14]。本实验结果发现，与正常对照组比较，心肌纤维化组大鼠LVEF、LVFS、LVSP降低，LVEDP升高；炙甘草汤各剂量组大鼠LVEF、LVFS、LVSP呈剂量依赖性升高，LVEDP呈剂量依赖性降低。提示炙甘草汤能够呈剂量依赖性的显著改善心肌纤维化大鼠的心功能。

TNF-α是一种炎症诱导因子，其在心肌纤维化进展中起着重要作用[15]。沈雁等[16]研究指出TNF-α参与了心肌纤维化病理进展的调控过程，抑制TNF-α水平能够抑制心脏成纤维细胞的增殖，进而抑制心肌纤维化的发生和发展。TGF-β1作为一种成纤维因子，在诱导胶原沉积及心肌纤维化过程中发挥重要作用。任学娇等[17]研究发现在心肌纤维化大鼠心肌组织中TGF-β1水平明显升高，而抑制TGF-β1水平则能够改善心功能及减轻心肌纤维化程度。Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白水平升高可促进心肌胶原沉积，进而加重心肌纤维化程度。张志刚等[18]研究发现心肌纤维化大鼠Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白水平显著升高，二者水平可随着心肌组织纤维化程度的减轻而明显降低。本实验结果显示，心肌纤维化组大鼠心肌组织中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白水平较正常对照组显著升高，心肌组织呈明显纤维化改变；炙甘草汤各剂量组大鼠心肌组织中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白水平呈剂量依赖性降低，心肌组织纤维化改变减轻。这提示炙甘草汤能够通过降低心肌纤维化诱导刺激因子水平，进而逆转心肌组织的病理性改变。

NF-κB作为细胞对体内炎症因子及多种刺激因子响应的信号通路，在肝、肺等多种组织器官纤维化过程中发挥着重要作用。近年来研究表明，NF-κB信号通路激活后可诱导体内炎症因子在心肌组织聚集，进而诱导心肌成纤维细胞增殖，加重胶原沉积，诱导心肌纤维化的发生[19]。符丽娟等[20]研究发现，心肌纤维化大鼠体内NF-κB通路过度激活，而抑制NF-κB通路的异常激活可明显减轻心肌组织氧化应激损伤程度，抑制炎症因子的释放，减少心肌间质纤维。吴志雄等[21]发现抑制糖尿病心肌纤维化大鼠NF-κB表达能够减少大鼠心肌组织胶原沉积及抑制纤维化进展。李博涛等[22]证实NF-κB通路参与了大鼠心肌纤维化过程，替米沙坦能够通过降低心肌组织中NF-κB表达水平改善大鼠心功能，抑制心肌纤维化。吡咯二硫氨基甲酸酯是药理作用机制明确的NF-κB通路抑制剂[23]，所以本实验使用该药作为阳性对照药物。本实验结果显示，炙甘草汤各剂量组及吡咯二硫氨基甲酸酯组大鼠心肌组织中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平及NF-κB p65 mRNA相对表达量均明显低于心肌纤维化组，且各指标随着炙甘草汤剂量的增加而逐渐降低，提示炙甘草汤可剂量依赖性的抑制大鼠心肌组织NF-κB表达，进而改善大鼠心功能并抑制纤维化进展。

综上所述，炙甘草汤能够改善异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化大鼠心功能，抑制大鼠心肌纤维化改变，其机制可能与调节NF-κB信号通路有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。