机械敏感分子踝蛋白-1在动脉粥样硬化小鼠中表达和意义

李明轩 邓丽佳 党硕 李史恬 阿依木古丽·艾尼 聂永梅 李静

(新疆医科大学 1第一临床医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2基础医学院；3第二临床医学院；4西南医科大学附属医院)

动脉粥样硬化(AS)被称为世界疾病中的头号杀手，表现为AS斑块的出现与发展。血管内皮受到血流的低剪切应力从而导致损伤和修复的失衡是形成AS斑块的原因〔1〕。脉管系统在层流低剪切应力作用下会使巨噬细胞和血小板在血管内膜浸润、泡沫细胞形成、斑块产生等一系列AS标志性进程发生〔1〕。踝蛋白(Talin)作为一种结合并激活整合素的细胞骨架蛋白，通过连接肌动蛋白细胞骨架和膜整合素，将来自胞外的机械信号转化为胞内的化学信号，这一过程称为机械转导〔2，3〕。Talin-1在血流剪切应力的诱导下发生机械解折叠会暴露新的识别位点，从而募集并结合参与机械转导的细胞骨架蛋白，形成稳定的黏附复合物，以此影响AS斑块的病理进程〔4〕。本研究主要分析Talin-1与AS小鼠血清脂质参数之间的相关性，探讨Talin-1在AS发生发展中的作用及其作为AS早期诊断分子标志物的可能性。

1 材料与方法

1.1材料 Talin-1兔抗小鼠多克隆抗体(abcam，USA)，荧光素5-异硫氰酸酯(FITC)荧光素标记山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗(AiMeijie Technology，武汉)，全自动生化分析仪(BK-360)；冰冻切片包埋剂(OCT，SAKURA，JPN)；冰冻切片机(Leica-1520)；荧光抗淬灭剂及细胞核染色剂(DAPI，Thermo Fisher，US)；小鼠Talin-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(MyBioSouce，USA)。

1.2动物模型的建立与取材 购自北京华阜康生物科技有限公司C57BL/6J ApoE-/-小鼠及C57BL/6J小鼠各8只，雄性，6周龄，体重(20±2)g，所有小鼠均于SPF环境饲养，温度20℃～25℃，湿度50%～60%，每天光照12 h，使用含21%脂肪，34%蔗糖，0.15%胆固醇的西方饲料喂养ApoE-/-小鼠作为实验组，对照组野生型小鼠给予正常饲料，饲养8 w以复制早期AS动物模型。

两组小鼠定期称重，于饲养8周末，将各组小鼠禁食12 h，腹腔注射苯巴比妥钠麻醉后于眼窝静脉丛取血约700 μl，静置30 min，离心10 min(3 000 r/min)取血清，分别于-80℃备用。固定小鼠，沿颈部中线做切口，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液灌注心脏以冲净血液，游离出主动脉根部至升胸主动脉部分的血管，4%多聚甲醛固定12 h后沉糖，OCT包埋，-80℃环境保存。

1.3血脂测定 全自动生化分析仪检测脂质参数总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。

1.4病理组织形态检测 将OCT包埋的组织于-20℃恒温环境下，采取横断面连续切片的方法，行苏木素-伊红(HE)染色判断AS发生发展的程度，光镜下观察并采图。

1.5免疫荧光法 冰冻切片(6 μm)用4%的多聚甲醛固定15 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液避光封闭1 h；滴加足量兔抗鼠的Talin-1多克隆抗体(1∶200)，4℃孵育过夜；去除多余液体后添加FITC荧光素标记山羊抗兔IgG(1∶50)，室温孵育2 h；滴加含DAPI的抗淬灭剂；荧光倒置显微镜下观察结果。荧光强度半定量分析使用Image Pro Plus 6.0软件完成。

1.6ELISA检测可溶性Talin-1(sTalin-1)表达 按照小鼠Talin-1 ELISA试剂盒说明书，将样品 OD值转化为浓度(ng/ml)，并运用CurveExpert 1.3软件绘制标准曲线(r=0.9997)，测定血清sTalin-1表达量。

1.7统计学方法 采用SPSS18.0软件进行独立样本t检验、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1小鼠血脂检测 实验组TC、TG、LDL-C、HDL-C显著高于对照组(P<0.01)，见表1。

表1 两组血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量对比

2.2病理学形态观察 对照组血管管腔结构清晰，具有明显的内膜、中膜和外膜结构；血管内皮完整，无炎性细胞浸润，无脂质聚积。实验组则出现典型的血管壁增厚，部分内膜破损，炎性细胞浸润，弹性纤维破坏，内膜表面有纤维组织的增生，部分血管腔出现AS斑块，管腔狭窄，结合血脂四项参数分析，AS小鼠模型建立成功。见图1。

图1 主动脉弓和主动脉根部HE染色(×40)

2.3免疫荧光检测病灶组织中Talin-1的表达 FITC标记的Talin-1为绿色荧光，DAPI染色的细胞核为蓝色荧光，Talin-1在实验组主动脉弓和主动脉根部内膜和中膜呈阳性表达，对照组主动脉组织中Talin-1表达阳性的细胞浸润较少，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图2、表2。

图2 免疫荧光检测Talin-1的表达(×100)

2.4各组血清中sTalin-1的表达 实验组血清sTalin-1显著高于对照组(P<0.05)。见表2。相关性分析显示sTalin-1与TC(r=0.987，P<0.001)、TG(r=0.928，P=0.001)、LDL-C(r=0.984，P<0.001)呈正相关，且差异具有统计学意义，与HDL-C无显著相关性(r=0.720，P=0.066)。

表2 Talin-1在主动脉弓和主动脉根部及血清中sTalin-1的表达

3 讨 论

AS的发生是大多数心血管疾病共同的病理基础，临床心血管疾病首先出现症状通常是在AS斑块已经成型并发展为中后期的阶段，而从动脉壁发生异常到出现临床症状一般需要经过数十年甚至更长的亚临床期，仅仅通过经典的危险因素和评分量表(如Framingham风险评分)来估计AS和心血管事件的进展是不充分的，而疾病的分子标记物可以迅速、准确的筛查疾病的发生发展，具有重要临床意义。

目前对于AS标志物的研究主要集中于早期及临床前期的动脉壁改变标志物和循环标志物。对于动脉壁的形态改变可以通过高分辨率B超来测量内膜中层厚度(IMT)，IMT的测量作为一种直观并且可量化AS危险程度的方法成为早期AS的确诊标准和对心血管风险评估的首选方法之一〔5〕，然而目前对于IMT的测量方法及如何在正常组织和病理组织之间设定精确的IMT阈值仍存在较大争议。研究表明，超敏C-反应蛋白(hsCRP)可以诱导组织因子的表达、激活补体、介导单核细胞的迁移和巨噬细胞对LDL的摄取，整合总体细胞因子下游的信号通路，对血管疾病的进展有着直接作用，因此hsCRP被认为是最有希望的循环标志物〔6〕。然而，通过22项前瞻性研究的多元分析发现，在平衡其他危险因素后，hsCRP对风险预测的价值低于预期〔7〕。但有研究显示，内皮细胞加载低剪切应力将导致部分区域内皮功能障碍〔1〕，并形成大量细胞因子、细胞外基质蛋白组成的AS微环境〔8〕，虽然AS毫无疑问是由脂质驱动的炎性病理过程，但在血脂水平正常的情况下，AS微环境也可以通过整合素来调节斑块发生位置，并增加AS相关细胞在血流应力刺激下的敏感性〔9〕。

整合素已被证实作为重要的细胞膜表面机械信号感受器，在AS微环境中发挥重要作用〔10，11〕。事实上，已经有研究发现AS斑块和动脉外膜中整合素表达上调，并与IMT有着强相关性，提出将整合素作为AS的分子标志物〔12〕。由于整合素不具备激酶活性，故需要通过募集Talin-1等细胞骨架蛋白形成黏着斑来维持整合素与肌动蛋白丝的稳定性，通过拉伸细胞外基质和增强细胞内肌动球蛋白收缩力，来增强肌动蛋白丝束，从而快速建立黏附位点结构，增强AS相关细胞的迁移、黏附能力〔13〕。而Talin-1作为整合素从被激活到高亲和力构象改变这一过程的重要标志〔14〕，也是形成黏着斑的重要结构蛋白，其大小为270 kD(包含2 541个氨基酸)〔15〕。Talin-1分子包含位于N端的两个整合素结合位点和位于C端的三个肌动蛋白结合域(ABDs)，其N端头部可以结合整合素亚单位近膜端，诱导整合素发生构象变化并激活整合素〔16〕。C端也能与整合素β链、肌动蛋白、纽蛋白相结合，以此来为蛋白质复合物的组装提供支架〔17〕。Talin与整合素的连接以一种“桥梁”的作用机械耦联细胞与周围环境，将来自AS微环境的机械信号转化为细胞内化学信号，调控细胞的运动迁移等生物学行为。

Talin对整合素的激活至关重要。Talin基因的敲除可以导致整合素无法活化及启动下游的级联反应，中国仓鼠卵巢细胞模型是研究Talin与整合素作用机制中普遍被接受的模型，其中Talin可以与整合素的β3尾部结合并激活整合素从而促进卵巢细胞的增殖迁移〔18〕。Chinthalapudi等〔19〕使用Talin-1-/-卵巢细胞在共聚焦显微镜下发现黏着斑的形成和整合素的激活都被抑制，而向细胞内引入Talin-1基因则可以恢复整合素的活化，并使下游的生理反应正常进行〔20〕。Kopp等〔21〕发现，敲低Talin-1在内皮细胞的黏附、迁移等生物学行为中起到负性调控的作用。由此推测，Talin-1作为一种细胞骨架蛋白与细胞的增殖、迁移、黏附、侵袭及AS的发生、发展等密切相关。基于Talin-1独特的机械转导特性赋予了癌细胞增殖、扩散的能力，sTalin-1与甲胎蛋白(AFP)等传统标记物进行比较后发现，sTalin-1具有更高的特异性和敏感性，可以作为前列腺癌〔22〕、鼻咽癌〔23〕、肝癌〔24〕的新型生物标志物。

本实验使用高脂饲养ApoE-/-小鼠8 w的方法来构建早期AS动物模型〔25〕，为后续实验奠定基础。应用免疫荧光在组织学水平对Talin-1的含量进行定量和定位检测，与对照组比较，实验组Talin-1在血管病灶中表达上调，然而Von等〔26〕检测了来自坦佩雷大学血管研究所(TVS)的动脉粥样硬化样本发现，Talin-1在粥样斑块中的表达低于健康血管，推测可能是由于TVS样本均为AS晚期，与本实验所用的AS早期模型不同，参与组成斑块的细胞成分发生巨大改变，因此造成了早期AS血管病灶中Talin-1的表达较高，而晚期AS血管病灶中Talin-1表达降低的结果，但其中的具体机制仍需进一步分析。

本实验ELISA检测结果表明Talin-1可能与AS的发病机制有关，相关分析显示sTalin-1与血脂参数的水平变化存在显著的正相关关系，这种相关性有可能在AS斑块形成的病理过程中起到重要作用，通过测定sTalin-1对于判断AS患者的病情有一定的临床意义。

综上，Talin-1表达上调可能是斑块最初形成的触发因素之一，引起这种上调的原因可能由外部因素引起，如剪切应力改变及血压升高，导致参与组成AS微环境的细胞发生改变。另外，推测基因层面也可能导致AS斑块中Talin-1上调。研究表明，机械传感和机械转导会影响DNA的包装和蛋白质组成的变化，基因突致使人群中AS的易感性升高〔27〕。sTalin-1参与组成机械信号感受器，可能在AS斑块的形成和疾病的进展中起到关键作用，具有成为早期AS循环标志物的潜力，也为AS的早期确诊奠定实验基础。