吉林汉族骨关节炎患者与KIR及配体关联性

韩瑜 叶壮 杨帆 张晶莹 赵令 于江虹 焦立新

(1长春市中心血站输血研究所，吉林 长春 130000；2吉林大学第一医院风湿免疫科；3吉林省疾病预防控制中心)

骨关节炎(OA)是人体能动关节的一种退行性疾病，老年人多见，以关节疼痛、活动受限等为主要临床症状〔1〕。OA的确切病因未明，以前只是简单地认为OA是由于关节磨损而受到的损害，而现在一致认为OA是由局部和系统因素的复杂作用而造成的〔2〕。有文献报道，OA患者外周血及滑液中调节性T细胞数量变化显著，Th17和Th1/17细胞数增多。这说明在OA患者滑膜腔中有免疫细胞的激活〔3〕，免疫因素可能在OA的发生中发挥调节作用。自然杀伤(NK)细胞是人体重要的免疫细胞，在天然免疫方面起着重要的作用。NK细胞功能的发挥主要依赖于杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，它通过与靶细胞表面相应的人白细胞抗原(HLA)Ⅰ类分子结合，传导激活或抑制信号来调节NK细胞和部分T细胞活性，在造血干细胞移植、母胎耐受、抗感染免疫及自身免疫性疾病等方面发挥调节作用〔4〕。在以往实验中，我们对吉林地区的汉族健康人群的KIR及配体的多态性进行了分析〔5〕，本研究采用PCR-SSP的方法继续对吉林地区的OA患者进行KIR及HLA配体复合体分型，分析并探讨免疫因素在OA发病机制中的作用。

1 对象与方法

1.1试剂与仪器 DNA提取试剂盒(批号：20081410T146，西安天隆科技有限公司)；核酸自动化提取系统(EZBead system-32，美国TBG)；凝胶成像分析系统(JY04S-3C，北京君意东方)；超微量微孔板分光光度计(Epoch，美国Bio-Tek公司)。

1.2研究对象 ①OA组：采集2019年1月至2020年2月吉林大学第一临床医院风湿免疫科门诊及住院OA患者135例。男48例，女87例，平均年龄(62.53±5.88)岁。临床诊断OA患者，均符合2018年中华医学会骨科学分会关节外科学组《骨关节炎诊断及治疗指南》的诊断标准〔6〕，排除合并类风湿关节炎或其他骨关节系统疾病病史的患者。②正常对照组：选取同期来自体检中心年龄相当的140名健康体检者作为正常对照组，男45例，女95例，平均年龄(61.77±6.56)岁，均签署知情同意书。OA组与正常对照组年龄、性别等一般资料方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。征其同意后抽取2 ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血，冻存于-80℃冰箱备用。

1.3基因组DNA提取 采用全血基因组核酸提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书，使用核酸自动化提取系统提取基因组DNA。DNA 浓度20～100 ng/μl，A260/A280 为1.7～2.0。

1.4基因分型 KIR基因及HLA配体基因的检测采用PCR-SSP方法，引物序列、PCR体系和循环条件参照文献〔7，8〕。取 10 μl PCR扩增产物加样于2%琼脂糖凝胶，在0.5×TBE 缓冲液中，10 V/cm 电泳 20 min，全自动凝胶成像系统拍照记录结果。

1.5KIR与HLA配体频率计算 参照文献〔9〕方法通过直接计数计算，频率(%)=阳性基因数/研究组总人数；KIR/HLA 配体复合体的出现频率按照如下受配体的识别方式进行：KIR2DL1+HLA-C2，KIR2DL2/3+HLA-C1，KIR2DS1+HLA-C2，KIR2DS2+HLA-C1和KIR3DS1+ HLA-Bw4(HLA-A Bw4，HLA-B Bw4T，HLA-B Bw4I)，KIR3DL1+HLA-Bw4(HLA-A Bw4，HLA-B Bw4T，HLA-B Bw4I)。

1.6统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件进行χ2检验。

2 结 果

2.1KIR基因及HLA配体电泳结果 目的片段大小均与预期结果相符(图1、2)。

M：Marker; 1～12：2DL4_B,3DL2_A,3DL3_B；2DS2_B,3DP1；2DP1_A,2DS2_A；3DL3A,2DS5_B,3DL2_B；2DS4_B,2DS5_A；2DS4_A,3DL1_B,2DL1_A；2DL3_A,2DS3_A,3DS1_B；2DL3_B,2DL4_A；2DL5_A,2DL5_B,2DS1；3DL1_A,3DS1_A,DRB1；2DS3_B,2DP1_B；2DL1_B,2DL2_A,2DL2_B图1 KIR 基因的 PCR-SSP 分型结果

M：Marker；1～5：HLA-A Bw4，HLA-B Bw4I,HLA-B Bw4T,HLA-C2,HLA-C1图2 HLA配体的 PCR-SSP 分型结果

2.2吉林地区OA组和对照组KIR基因频率 OA患者中框架基因KIR3DL2、KIR3DL3和KIR2DP1频率为100%。OA患者中KIR2DL2、KIR2DL5和KIR2DS1基因频率分别是27.41%、42.96%、41.48%，显著高于正常对照组的16.43%、30%、29.29%(P<0.05)。其余两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 吉林地区OA组和正常对照组KIR基因频率比较〔n(%)〕

2.3吉林地区OA组和正常对照组HLA配体频率比较 表2可见，正常对照组HLA-A Bw4的基因频率显著高于OA组(P<0.05)。其余HLA配体的基因在正常对照组和OA组中出现频率较为相近，差异比较无统计学意义(P>0.05)。

表2 吉林地区OA组和正常对照组HLA配体频率比较〔n(%)〕

2.4吉林地区OA组和正常对照组KIR/HLA受配体组合比较 由表3可见，KIR3DL1+HLA-Bw4在正常对照组的频率显著高于OA组(P<0.05)。KIR3DL1+HLA-A Bw4在正常对照组的频率，显著高于OA组(P<0.05)。而其他指标两组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 吉林地区OA组和正常对照组KIR/HLA受配体组合比较〔n(%)〕

3 讨 论

OA一直以来被认为是衰老过程中不可避免的现象，直到近期，才明确OA为一种独立的疾病，是一种与多种因素相关的，发生在多关节部位的退行性病变。流行病学调查发现，在60岁以上的老年人当中膝关节OA的发病率，男性为9.6%；女性高达18%〔10〕，但是OA的发病机制仍然不清，成为国内外学者研究的热点。

KIR的配体主要为HLA-Ⅰ类抗原，不同的KIR受体识别不同人类经典MHC-I分子HLA-A，-B和-C〔11〕，并进一步判别对象属于“自我”或“非我”，从而发挥其免疫调节作用。近年来，在自身免疫性疾病〔12〕、癌症〔13〕、传染病〔14〕和移植〔15〕等方面，KIR基因多态性越来越受到人们的关注。大量文献报道KIR基因多态性与多种自身免疫病相关。Yen等〔16〕报道在类风湿血管炎和类风湿关节炎中，KIR2DS1的频率显著升高；Jiao等〔17〕报道HLA-B27阳性患者与HLA-B27阳性对照组比较，KIR2DL1与KIR2DL5基因频率较高，KIR2DL5基因的频率高于对照组，同时HLA-Cw*08基因频率也显著升高。以上研究显示，在自身免疫性疾病中存在抑制型KIR基因频率降低，或(和)活化型KIR基因频率增高的情况。

本研究发现OA患者中抑制型KIR2DL2和KIR2DL5基因频率升高，而活化型KIR2DS1基因频率也升高，可能因为基因频率的变化导致NK细胞和部分T细胞抑制型受体和激活型受体之间的平衡受到破坏从而使其活化的域值降低，激活了NK细胞；进一步分析发现OA组中HLA-A Bw4的基因频率低于正常对照组，可能由于OA组KIR配体HLA-A Bw4基因水平降低从而使得HLA-A Bw4分子表达下调，激活了NK细胞；或KIR3DL1+HLA-A Bw4减少，KIR对NK细胞的抑制性减弱，相应的激活型受体增加，从而引起了OA的发生和发展。

当然，KIR及配体与OA的关联性，还需要进一步增加样本量进行证实，本研究只是进行了一个初步的探讨。总之，KIR作为一类重要的免疫调节分子，在机体免疫中发挥着重要的作用，随着我们对其结构、功能的深入研究，必将会为临床治疗提供新的免疫靶点。