miR-126对人喉鳞癌Hep2细胞迁移侵袭能力的影响

沙海滨 尹丽娥 马荣峰 徐佳鸿

(1胜利油田中心医院，山东 东营 257000；2山东省省立医院)

喉癌是成人头颈部常见的一种恶性肿瘤，喉鳞状细胞癌(LSCC)是该病主要的病理类型。目前研究认为喉癌是多种因素共同作用产生的结果，吸烟、饮酒、空气污染、病毒感染、性激素是其主要危险因素，这些危险因素引起了机体组织细胞内癌症相关因子的异常进而诱导肿瘤的发生〔1,2〕。miRNA是长度为23 nt左右的非编码类RNA分子，且其能与靶基因mRNA 3′非翻译区的的特异性相结合，并经过负性调控靶基因的转录表达，而参与到细胞增殖、凋亡、侵袭及迁徙等生物学的行为。因此其与多种疾病发生和发展紧密相关〔3,4〕。miR-126是一种位于表皮生长因子样结构域7的第7个内含子内的miRNA，在癌症中表达失调，并与肿瘤的血管生成、癌细胞增殖、侵袭、耐药等过程密切相关。目前研究显示miR-126在喉癌组织中低表达〔5,6〕，但具体机制未知，因此本研究分析miR-126对Hep2喉鳞状细胞的迁移及侵袭能力产生的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 DMEM培养基和胎牛血清均从美国Gibco公司购入；检测BCA蛋白浓度的试剂盒从南通碧云天生物公司购入；miR-126 mimics及miR-126 NC均从上海吉马生物公司购入；兔抗人基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、锌指转录因子(Snail)、锌指结合蛋白(ZEB)1蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化(p)-AKT及甘油醛-3的磷酸脱氢酶(GAPDH)相关多克隆抗体从美国的Abcam公司购入；用于提取Trizol总RNA的试剂盒和LipofectamineTM3000脂质体及反转录的试剂盒均从大连宝生物公司购入。Applied Biosystems7500型PCR仪从美国的ABI公司购入；NanoDrop ND-2000C型微量紫外分光光度计从美国的Thermo公司购入；Epics-XLⅡ型流式细胞仪从美国的Beckman Coulter公司购入；ChemiDocTMXRS型凝胶成像系统从美国的伯乐公司购入。

1.2细胞培养 由中科院上海细胞库提供细胞转染喉鳞状细胞癌的Hep2细胞。用无血清的Opti-MEM培养基对LipofectamineTM3000和miR-126 mimics(miR-126 mimics组)及miR-126 NC(miR-126 NC组)进行常规稀释，将稀释之后的LipofectamineTM3000同miRNA混匀，并在室温的环境中放置约30 min，形成miRNA-LipofectamineTM3000的复合物。在肝癌细胞中加入复合物，并培养6 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加以10%的胎牛血清并培养48 h,使用Realtime-PCR法对细胞中miR-126的表达实施检测。

1.3miR-126检测 使用Realtime-PCR法对Hep2细胞中miR-126 的表达进行检测，并收集细胞，使用Trizol法对细胞总RNA实施提取，采用光度计对RNA纯度进行计测，若OD260nm/OD280nm=1.8时，则说明RNA的纯度良好，且将RNA逆转录为cDNA，并将cDNA作为模板，放置于荧光定量PCR仪上施以检测，将U6记作内参，计算出细胞内miR-126的相对表达量。

1.4细胞活力检测 将Hep2细胞小心地平铺于96孔板上，使用MTT法对细胞的活力进行检测，并培养24 h，根据“1.2”转染细胞培养48 h，48 h后加入MTT后继续孵育4 h，然后去除上清液，同时每孔细胞中放入150 μl的二甲基亚砜，以溶解结晶物，在波长560 nm处对OD值进行测定。

1.5细胞迁移能力检测 将转染培养1 d后的细胞与transwell上室接种，且下室不予接种，加入10%的胎牛血清培养基，并培养48 h，48 h之后提取出小室。使用棉签将上室细胞轻轻擦去，而下室细胞则采用多聚甲醛进行固定，使用1%的结晶紫对其染色，并放置于200倍的显微镜下，以观察和计数穿越滤膜的有关细胞，计数后取平均值为细胞迁移的数目。

1.6transwell法检测细胞侵袭能力 基质胶用DMEM培养液稀释好，并平铺于8 μm的transwell上室。将转染1 d之后的有关细胞置于transwell上室内接种，且下室不予接种，加入10%的胎牛血清培养基，并培养48 h，而后提取出小室。使用棉签将上室细胞轻轻擦去，而下室细胞则采用多聚甲醛进行固定，使用1%的结晶紫对其染色，并放置于200倍的显微镜下，以观察和计数穿越滤膜的有关细胞，计数后取平均值为细胞迁移的数目。

1.7Western印迹法对细胞中蛋白表达进行检验 将转染培养之后细胞的培养皿放置于冰上，接着刮下细胞，并将含有蛋白酶抑制剂(PMSF)的液裂解细胞加入培养皿中，放置于4℃的环境中离心30 min，并收集其上清液。并对蛋白浓度的定量进行测定，样品上样之后，跑十二烷基苯磺酸钠的凝胶电泳，且转膜约30 min。加入5%脱脂奶粉后，在室温的环境下孵育1 h，一抗在溶液4℃的环境下过夜孵育，次日在室温的环境下孵育二抗，将化学发光的试剂加于膜上，在凝胶成像的系统中曝光，分析目的为蛋白条带的灰度值。

1.8统计学分析 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1miR-126 mimics转染情况 Realtime PCR测定的结果显示：miR-126 mimics组中miR-126的表达量(2.28±0.23)显著高于miR-126 NC组(1.00±0.12，P<0.05)。

2.2miR-126对Hep2细胞活力和迁移能力及侵袭能力的作用 MTT实验的结果显示：miR-126 mimics组细胞活力为(0.38±0.04)，明显低于miR-126 NC组(0.57±0.06，P<0.05)。transwell实验结果表明：miR-126 mimics组〔(38.43±3.84)个〕细胞迁移数目显著少于miR-126 NC组〔(158.68±15.87)个，P<0.05〕；miR-126 mimics组〔(44.29±4.43)个〕细胞侵袭数目显著少于miR-126 NC组〔(199.36±18.40)个，P<0.05〕。见图1、图2。

图1 miR-126对Hep2细胞迁移能力的影响(×200)

图2 miR-126对Hep2细胞侵袭能力的影响(×200)

2.3miR-126对Hep2细胞中MMP2、MMP9、Snail、ZEB1蛋白表达的影响 Western印迹miR-126 mimics组MMP2、MMP9、Snail、ZEB1蛋白表达量均显著低于miR-126 NC组(P<0.05)。见图3、表1。

图3 miR-126对Hep2细胞中MMP2、MMP9、Snail、ZEB1蛋白表达的影响

表1 miR-126对Hep2细胞中MMP2、MMP9、Snail、ZEB1、PI3K、p-Akt蛋白表达的影响

2.4miR-126对Hep2细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响 miR-126 mimics组PI3K、p-AKT蛋白表达量均显著低于miR-126 NC组(P<0.05)。见表1、图4。

图4 miR-126对Hep2细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨 论

miR-126是从小鼠心脏和小脑中发现的一种位于表皮生长因子样结构域7的第7个内含子内的miRNA，定位于人染色体9q34.3上。miR-126在内皮细胞中表达，miR-126在胚胎组织、消化系统、呼吸系统、生殖系统具有高度特异性，特别是对于心血管系统的特异性最高〔7～9〕。miR-126在心脏、肺等血管丰富的组织中高表达，而在大多数肿瘤组织中低表达，并与肿瘤的发生发展密切相关〔7～9〕。miR-126在肿瘤的诊断、预后等方面具有重要意义。目前研究显示miR-126通过调控如趋化因子受体4、人类溶质载体家族7成员5等参与多种信号通路的调控作用〔7～9〕。魏梅等〔5〕研究表明miR-126的高表达可以提高男性喉癌患者的总生存率，这种作用可能是通过其靶基因调节细胞代谢及凋亡过程实现的。Sun等〔6〕研究证实miR-126在喉癌患者的血浆中表达量显著下调，并与肿瘤的分化程度密切相关，而且通过抑制钙调素调节蛋白抗体(Camsap)1表达参与喉癌的转移。

本研究结果说明miRNA转染成功。MTT实验结果表明miR-126 mimics能显著降低Hep2细胞活力,transwell实验结果表明miR-126 mimics能显著抑制Hep2细胞的迁移及侵袭能力，这些结果同在非小细胞肺癌的细胞〔10〕和胶质瘤细胞〔11〕中miR-126的作用是相同的，提示miR-126的过表达可以抑制Hep2的细胞活力、迁移及侵袭能力。肿瘤的侵袭转移是喉癌患者术后预后不良的重要原因，因此抑制癌细胞的侵袭转移对于预后的改善具有重要意义。MMPs是一种几乎能够降解细胞外基质所有成分的锌依赖性内肽酶家族，在组织重构、血管生成、器官的发生发育、炎症反应、细胞迁移等过程中发挥重要作用。Snail是近些年发现的一种定位于人染色体20q12.3的锌转录因子，是上皮间充质转分化(EMT)的关键蛋白，在胚胎发育、伤口愈合、细胞的迁移侵袭、EMT的发生过程中发挥着重要作用。ZEB蛋白为核转录因子，含有ZEB1和ZEB2。ZEB1位于机体10号染色体的短臂，可以对高达32种miRNA进行转录〔12,13〕。研究表明ZEB1是EMT中非常重要的调控因子，对EMT的发生有促进作用。本文结果显示miR-126的过表达可以有效下调MMP2、MMP9、Snail、ZEB1的表达，可以对Hep2细胞的迁移及侵袭有效抑制。

PI3K/AKT信号通路别名为抗凋亡的信号通路，可以高度激活与多数的肿瘤组织中〔14,15〕。若PI3K被其上游生长的因子进行刺激后，可以使磷脂酰二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)3′羟基获得磷酸化，同时转化为三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，使AKT的结构出现变化，在丝氨酸/苏氨酸的位点磷酸化，活化的AKT对下游靶蛋白的表达施以进一步的调控，并参与细胞增殖和血管生成、侵袭及迁移等生物学的行为〔14,15〕。因此本研究进一步探讨miR-126对Hep2细胞中PI3K/AKT信号通路紧密相关蛋白的表达生成的影响，结果显示miR-126过表达可以降低PI3K和p-AKT表达，进而对Hep2细胞的迁移及侵袭进行抑制。