积雪草酸通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制A549细胞的增殖和迁移

王子健 庄作会 刘春霞

(1山东第一医科大学研究生部，山东 济南 250118；济宁市中西医结合医院 2肺病脾胃病科；3肿瘤科)

肺癌属于死亡率最高的肿瘤之一〔1〕。且非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌患者的80%〔2〕。目前，手术治疗、化学治疗、放射治疗及免疫疗法是NSCLC的主要治疗方法，由于早期NSCLC患者无特异性临床体征，多数患者在初诊时已处于中晚期，这导致全球NSCLC患者5年生存率仅为18%〔3,4〕。因此，迫切需要寻找更有效的治疗NSCLC的方法。研究表明，中草药具有广泛的抗癌作用和低副作用，越来越多的中草药被单独使用或与经典的抗癌药物联合作用，从而预防甚至治疗癌症〔5〕。积雪草酸(AA)是一种天然存在的五环三萜类化合物，存在于许多植物中，包括积雪草、普氏藻、海棠和桉树等〔6〕。据研究，AA可以抑制肝癌和鼻咽癌的恶性进展〔7,8〕。机制上，AA可以通过调控Smad3/Smad7信号通路在肿瘤中发挥抑制作用〔9〕。然而AA在NSCLC中的生物学功能及其作用机制尚待研究。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/重组人丝氨酸-苏氨酸激酶(AKT)1/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路与人类肿瘤的发生和发展密切相关〔10,11〕。据研究，PI3K/AKT/mTOR信号通路参与NSCLC细胞的生长、增殖和转移等生物学进程〔12,13〕。然而NSCLC细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路是否受到AA的调控尚不清楚。本研究旨在探讨AA对NSCLC细胞增殖和迁移的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人NSCLC细胞A549购自中国典型培养物保藏中心。CCK-8细胞计数试剂盒、RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒和电化学发光(ECL)显影试剂盒购自中国碧云天生物技术。相关蛋白的一抗和二抗均购于美国Abcam。

1.2细胞培养与分组 DMEM 培养基培养A549细胞，含 10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。并置于37℃，5%CO2的饱和湿度的培养箱中培养。每3 d换培养液1次，细胞对数期使用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。将对数期的A549细胞分别用0、10、20、30、40 μg/ml的AA处理，计为Control组、10 μg/ml组、20 μg/ml组、30 μg/ml组和40 μg/ml组。

1.3CCK-8法测定细胞活力 将各组A549细胞以1×105/孔种植于96孔板上。于培养24、48、72、96 h时每孔加入10 μl的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内继续孵育4 h，使用微孔板读数仪分别测量细胞的光密度OD(450 nm)。

1.4BrdU检测细胞增殖 将各组A549以按1×105个/孔接种于24孔板。按说明书加入BrdU标记试剂，并将孔板置于5%CO2、37℃培养箱内培养；连续培养细胞共48 h后，按Sigma公司BrdU抗体操作说明进行细胞免疫荧光染色。红色荧光标记增殖的细胞，蓝色荧光标记细胞总数，细胞增殖率=BrdU阳性细胞数/DAPI阳性细胞数，取3个视野细胞增殖率的平均值为细胞的增殖率。

1.5细胞划痕实验检测细胞迁移 将各组A549细胞制成细胞悬液，以1×106/ml的密度种植于6孔培养板中，待细胞铺满后，用枪头垂直于培养板划线。磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，并使用AA(0、10、20 μg/ml)溶液处理，于37℃，5%CO2环境下培养。于0、24 h取样、拍照。

1.6Western印迹 RIPA溶液对各组A549细胞进行裂解，提取细胞总蛋白。用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白质样本的浓度。使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白提取物分离后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%牛血清白蛋白(BSA)处理膜室温1 h阻断非特异性结合，并与相关的一抗孵育12 h，然后用二抗室温孵育1 h。使用ECL显示蛋白质信号，Image J软件分析蛋白条带。

1.7统计学分析 采用SPSS26.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1AA对A549细胞活力的影响 在24、48、72 h随着AA浓度的增加，细胞活力逐渐降低(P<0.05)。见表1。后续实验将采用10、 20 μg/ml AA进行研究。

表1 CCK-8法检测AA对A549细胞活力变化

2.2AA对A549细胞增殖的作用 与Control组BrdU细胞阳性率〔(79.73±9.46)%〕相比，10 μg/ml组和20 μg/ml组〔(57.91±6.92)%、(27.83±4.06)%〕均显著降低(P<0.05)。见图1。

图1 BrdU检测A549细胞的增殖(免疫荧光，×400)

2.3AA对A549细胞迁移能力的影响 与Control组A549细胞划痕的愈合程度〔(72.35±8.42)%〕相比，10 μg/ml组和20 μg/ml组〔(49.36±7.98)%、(31.04±8.25)%〕显著降低(P<0.05)。见图2。

图2 细胞划痕实验检测A549细胞的迁移

2.4AA对A549细胞上皮间质转化(EMT)的影响 与Control组相比，10 μg/ml组和20 μg/ml组血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)-14、波形蛋白表达均显著降低，见图3、表2。

表2 Western印迹检测EMT相关蛋白表达的变化

图3 Western印迹检测EMT相关蛋白表达的变化

2.5AA对A549细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响 与Control组相比，10 μg/ml组和20 μg/ml组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的表达水平均显著降低(P<0.05)。见图4、表3。

图4 Western印迹检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达

表3 Western印迹检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达

3 讨 论

研究证实中草药在多种恶行肿瘤中具有显著的抗癌作用〔14～16〕。研究报道AA通过抑制多耐药基因(MDR)1诱导人肺腺癌A549/DDP细胞对顺铂(DDP)敏感，并通过PI3K/AKT信号通路抑制(WAVE)3的活化抑制乳腺癌细胞的侵袭和增殖〔17,18〕。AA可以通过破坏线粒体的结构在体外和体内抑制肺癌的生长〔19〕。研究表明，AA可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号传导途径抑制人结肠癌细胞的增殖和迁移，并诱导其凋亡〔20〕。

EMT是指上皮性质的细胞出现了间质细胞的特性，从而促进细胞的迁移、侵袭和浸润〔21〕。VEGF能促进血管通透性增加和血管形成等作用；MMP-14与肿瘤细胞的迁移、侵袭相关；波形蛋白是中间丝的其中一种蛋白质，其与肿瘤的发生和转移密切相关〔22～24〕。本研究结果表明AA可参与抑制A549细胞的EMT进程。

PI3K/Akt/mTOR可参与细胞的生理和病理过程，其被异常激活发生磷酸化，从而促进前列腺癌和乳腺癌恶行进展〔25～27〕。研究报道，乙酰紫草素通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路磷酸化抑制结直肠癌生长〔28〕；虎杖苷通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路磷酸化诱导人宫颈癌细胞凋亡〔29〕。而AA可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路磷酸化在人卵巢癌细胞中发挥抑癌作用〔30〕。

本研究表明，AA可抑制A549细胞的增殖活力；降低细胞迁移能力;抑制VEGF、MMP-14、和Vimentin蛋白的表达；进一步研究表明AA可抑制p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表达。