miR-105-5p靶向THBS1调节神经炎症和神经元凋亡参与阿尔茨海默病进展

郑佳林 郭丽璇 金惠英 吴静

(成都中医药大学附属医院检验科，四川 成都 610075)

阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病，研究表明抑制神经元的炎症反应和凋亡是AD的潜在治疗靶点〔1,2〕。目前已有研究发现，miRNA在AD患者的外周血中失调，可作为AD的候选生物标志物〔3,4〕。miR-105-5p在帕金森病患者及神经疾病患者血浆中异常上调，可作为帕金森病的潜在生物标志物〔5〕。然而，关于miR-105-5p在AD中的作用及下游机制未见研究。本研究旨在分析miR-105-5p对AD体外模型细胞增殖、凋亡和炎症反应的影响，并进一步识别miR-105-5p的作用。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12购自美国典型物保藏中心；10%胎牛血清(FBS)、RPMI1640培养基、胰蛋白酶、Lipofectamin2000、TRIzol试剂购自美国Thermo Fisher公司；逆转录试剂盒购自TaKaRa公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒、RIPA裂解液、CCK-8试剂盒购自中国碧云天公司；miR-105-5p模拟物(miR-105-5p mimic)及阴性对照(NC mimic)、miR-105-5p抑制剂(miR-105-5p inhibitor)及阴性对照(NC inhibitor)、THBS1过表达质粒(pc-THBS1)及阴性对照(pc-NC)均购自上海吉满生物科技有限公司；Renilla-GloTM萤光素酶检测系统购自美国Promega公司；anti-THBS1、anti-GAPDH及辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自上海艾博抗公司；MCO-18AC细胞培养箱均购自日本Panasonic公司；ABI-7300型荧光定量PCR仪均购自美国ABI公司；ST-360型全自动酶标仪购自上海科华医疗设备有限公司；DYCZ-25D型蛋白电泳仪购自北京六一生物科技有限公司。

1.2细胞培养与分组 将PC12细胞培养于含10% FBS的RPMI-1640培养基中，并添加100 U/ml的青霉素连续培养至对数生长期。将对数生长期的PC12细胞使用胰蛋白酶消化并离心重悬，调整细胞密度为1×105/ml，接种于96孔板中培养至80%汇合。将PC12细胞分为对照组(正常培养状态下的PC12细胞)、模型组〔25 μmol/L β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导PC12细胞〕、NC inhibitor组(转染NC inhibitor至模型组细胞)、miR-105-5p inhibitor组(转染miR-105-5p inhibitor至模型组细胞)、NC mimic组(转染NC mimic至模型组细胞)、miR-105-5p mimic组(转染miR-105-5p mimic至模型组细胞)、miR-105-5p inhibitor+si-NC组(转染si-NC和miR-105-5p inhibitor至模型组细胞)、miR-105-5p inhibitor+si-THBS1组(转染miR-105-5p inhibitor和si-THBS1至模型组细胞)。

1.3实时荧光定量-聚合酶链式反应(qRT-PCR) 收集各组细胞，在冰上裂解匀浆后Trizol试剂提取细胞总RNA。检测纯度后使用逆转录试剂盒将其反转录为cDNA，在ABI-7300上进行qRT-PCR。以GAPDH和U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-105-5p和THBS1mRNA的相对表达量。各分子引物序列如下：miR-105-5p:正义链5′-TCGGCAGGTCAAATGCTCAGACTCC-3′,反义链5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；THBS1：正义链5′-AGACTCCGCATCGCAAAGG-3′,反义链5′-TCACCACGTTGTTGTCAAGGG-3′；GAPDH：正义链5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,反义链5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；U6：正义链5′-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3′，反义链5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′。

1.4酶联免疫吸附试验(ELISA) 使用ELISA试剂盒检测各组转染组中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β水平。将各组细胞以5×105/孔的密度接种于6孔板中，收集各转染组细胞培养上清液，根据制造商的说明，依次滴加一抗工作液、酶标抗体工作液、底物工作液及反应终止液，在450 nm处检测各组吸光度值，根据标准曲线计算各组TNF-α及IL-1β水平。

1.5CCK-8实验 将各转染组细胞以5 000个/孔的密度接种于96孔板中，在细胞培养箱中继续培养。分别在第24 h、48 h和72 h时，向每孔中滴加10 μl的CCK-8试剂。37℃下孵育1 h后，在酶标仪上分别测量各组细胞吸光度值(OD=450 nm)。

1.6流式细胞术 使用胰酶消化细胞，收集细胞接种于6孔板后继续培养24 h，弃去上清液。根据AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒说明：使用4℃的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，1×结合缓冲液重悬细胞，在细胞悬液中加入AnnexinV-FITC和PI，避光环境下室温孵育15 min，并在1 h内用流式细胞仪检测各组PC12细胞凋亡率。

1.7双荧光素酶报告实验 通过StarBase数据库预测可能与miR-105-5p结合的靶基因，以THBS1为研究对象。使用Lipofectamine2000将THBS1-WT或THBS1-MUT与NC mimic或miR-105-5p mimic共转染至PC12细胞中，转染48h后分析各组荧光素酶活性。

1.8Western印迹 使用RIPA裂解液裂解各组细胞，提取总蛋白并用二喹啉甲酸(BCA)法测定浓度。10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脱脂牛奶封闭。与适当稀释的一抗(anti-THBS1)和anti-GAPDH在4℃下孵育过夜，次日取出TBST洗膜后与HRP标记的二抗工作液在室温下孵育1 h。电化学发光(ECL)试剂显色成像，Image J计算灰度值。

1.9统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验及方差分析。

2 结 果

2.1各组miR-105-5p和THBS1表达水平比较 与对照组miR-105-5p的表达水平(1.011±0.127)相比，模型组(1.731±0.070)显著上调(P<0.05)，与对照组THBS1的表达水平(1.000±0.081)相比，模型组(0.470±0.161)显著下调(P<0.05)。

2.2两组TNF-α、IL-1β水平比较 与对照组相比，模型组TNF-α和IL-1β水平均显著升高；与NC inhibitor组相比，miR-105-5p inhibitor组TNF-α和IL-1β水平均显著下降(均P<0.05)，见表1。

2.3各组细胞凋亡率及细胞活力比较 与对照组细胞的凋亡率相比，模型组显著升高(P<0.05)，与NC inhibitor组细胞凋亡率相比，miR-105-5p inhibitor组显著下降(P<0.05)。转染48 h后，与对照组细胞活力相比，模型组显著降低(P<0.05)与NC inhibitor组细胞活力相比，miR-105-5p inhibitor组显著升高(P<0.05)。见表1、图1。

图1 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

表1 各组TNF-α、IL-1β、细胞凋亡率、细胞活力比较

2.4miR-105-5p和THBS1的靶向结合关系 通过在线数据库StarBase预测到miR-105-5p与THBS13′UTR之间存在结合位点。THBS1-WT+NC mimic组与THBS1-WT+miR-105-5p mimic组的荧光素酶活性分别为1.02±0.11与0.72±0.07，两组差异有统计学意义(P<0.05)，THBS1-MUT+NC mimic组与THBS1-MUT+miR-105-5p组荧光素酶活性分别为1.03±0.10与0.91±0.09，组间差异无统计学意义(P>0.05)；与NC mimic组THBS1蛋白水平(1.06±0.14)相比，miR-105-5p的过表达(0.23±0.04)可显著降低THBS1在AD细胞模型中的蛋白水平(P<0.05)，见图2。

图2 miR-105-5p靶基因的预测及过表达miR-326对THBS1蛋白水平的影响

2.5下调miR-105-5p和THBS1对AD模型细胞中炎症因子的影响 miR-105-5p inhibitor+si-THBS1组TNF-α及IL-1β水平显著高于miR-105-5p inhibitor+si-NC组(P<0.05)，见表3。

2.6下调miR-105-5p和THBS1对AD模型细胞增殖和凋亡的影响 与miR-105-5p inhibitor+si-NC组相比，miR-105-5p inhibitor+si-THBS1组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，转染48 h后，miR-105-5p inhibitor+si-THBS1组细胞活力显著降低(均P<0.05)，见表3。

表3 转染miR-105-5p inhibitor和si-THBS1对细胞中炎症因子水平、细胞增殖、细胞凋亡率的影响

3 讨 论

miRNA被证实可通过调控AD中相关生物标志物参与AD进展〔6〕。有研究表明miR-105-5p可在非小细胞肺癌细胞和胶质瘤细胞中发挥促凋亡作用并抑制癌细胞的恶性进展〔7,8〕。THBS1可与包括细胞受体、生长因子、细胞因子及蛋白酶在内的多种配体相互作用，从而调节各种生理和病理过程〔9,10〕。有研究表明，THBS1可通过维持线粒体动力学和线粒体功能的平衡，调控神经元细胞活性，是AD的潜在治疗靶点〔11〕。本研究实验结果提示miR-105-5p可调控AD模型细胞中的炎性介质的释放、细胞增殖与凋亡。