冠心病患者与健康人群外周血中内皮祖细胞微小RNA表达

刘一炫 赵雅红 谢富兰 蒙荣森 靳文

(广东省第二人民医院心内三科，广东 广州 510300)

微小RNAs(miRNA)是在真核生物中存在且保守进化的非编码内源性RNA单链小分子，在转录后调控中发挥作用。miRNA与冠心病心肌细胞缺氧缺血状态、血管壁细胞受损、脂质代谢变化等病理机制密切相关〔1〕。在急性心肌梗死中，miRNA-21可促进血管受损后新生内膜增生，对冠心病评估预后、诊断具有重要的临床价值。外周血内皮祖细胞在动脉粥样硬化的防治中具有重要作用，内皮细胞功能由多种miRNA进行调控，促进血管内皮化和新生。有研究〔2〕指出，冠心病患者外周血中内皮祖细胞的数目较少，生成血管能力、迁移、黏附、增殖能力损伤。本研究探讨健康人群和冠心病病人外周血中内皮祖细胞miRNA的表达水平。

1 资料和方法

1.1一般资料 选择2016年6月至2017年3月广东省第二人民医院收治的冠心病患者60例为冠心病组，男37例，女23例，年龄42～77岁，平均(53.8±3.6)岁；体重指数(BMI)18～25 kg/m2，平均(23.7±1.8)kg/m2；病情严重程度：急性心肌梗死32例，心绞痛28例；病程2～7年，平均(4.5±2.1)年。纳入标准：符合世界卫生组织制定的冠心病诊断标准〔3〕；经冠状动脉造影、临床特征确诊。同期选择体检健康者60例为对照组，其中男36例，女24例，年龄42～77岁，平均(53.7±3.6)岁；BMI 18～25 kg/m2，平均(23.8±1.8)kg/m2。两组年龄、性别、BMI等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。研究对象均自愿参加本研究，并签署知情同意书。排除标准：排除对外周血内皮祖细胞的功能和数目产生影响的病变、血液系统病变、肿瘤、心肌病、梅毒、肝炎、哺乳期和妊娠女性、精神异常无法配合者，临床资料缺失者。

1.2仪器和试剂 湖北医药学院基础医学研究所提供二苯基四氮唑溴盐(MTT)、多聚甲醛、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(PBS)，麒麟医用仪器厂生产的Boyden 小室，Corning公司生产的96孔、24孔培养板，Thermo公司生产的酶标仪，Zeiss公司生产的激光扫描共聚焦荧光显微镜，Olympus生产的倒置相差显微镜，Binder公司生产的37℃恒温细胞培养箱，阿尔泰公司生产的超净工作台，Eppendorf公司生产的水平低速离心机，山东奥塞特医疗器械有限公司生产的5 ml肝素无菌抗凝管，Molecular Probe公司生产的Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白，Lonza公司生产的内皮细胞生长培养基(EGM)-2培养基，Millipore 公司生产的人纤维连接蛋白，Sigma公司生产的FITC标记的荆豆凝集素I、人淋巴细胞分离液。7500荧光定量RCR仪，无RNA酶纯水，无水乙醇，外源性cel-miR-39，荧光探针，实时荧光定量(qRT)-PCR试剂盒，RNA反转录试剂盒、总RNA提取试剂盒。miRNA-21序列为UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。

1.3方法

1.3.1鉴定、培养、分离内皮祖细胞 采集10 ml肘静脉血，密度梯度离心法收集外周血单个核细胞24孔细胞培养板包被人纤维连接蛋白，接种单个核细胞，EGM-2培养基培养4 d，非贴壁细胞予以PBS除去，培养液更换至1 w，予以Dil-acLDL及FITC-UEA-I标记细胞后，采用激光共聚焦显微镜鉴定，正在分化的内皮祖细胞为Dil-acLDL及FITC-UEA-I标记染色双阳性细胞。随机选择15个内皮祖细胞，在200倍视野下取平均值。

1.3.2迁移能力实验 收集贴壁细胞并消化，Boyden小室的下室加入50 μg/L血管内皮生长因子和200 μl培养液。相同数量的内皮祖细胞注入上室，在5%二氧化碳温箱内、37℃培养24 h；将滤膜上的未移动细胞刮去，予以甲醇3～5 min固定，DAPI染色10 min，冲洗蒸馏水，晾干后200倍显微镜下观察向底层迁移的细胞。

1.3.3增殖能力实验 收集贴壁细胞并消化，96孔细胞培养板包被人纤维连接蛋白，接种内皮祖细胞，每个标本设置空白对照3个复孔，二氧化碳培养箱内转移培养板，在饱和湿度、5%二氧化碳、37℃培养24 h，将20 μl MTT液体加入每孔内，培养4 h，除去上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，震荡器10 min充分震荡，在490 nm波长的酶标仪下检测吸光度。

1.3.4黏附能力实验 收集贴壁细胞并消化，96孔细胞培养板包被人纤维连接蛋白，接种相同数目的内皮祖细胞，在5%二氧化碳、37℃培养30 min，随机选择9个贴壁细胞，200倍荧光显微镜下计数。全部研究对象在空腹下采集2 ml外周静脉血，在4℃乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中放置，3 000 r/min离心10 min，-80℃保存上清液。行qRT-PCR检测外周血中内皮祖细胞miRNA-21、miRNA-150的表达水平。根据试剂说明书提取样品总RNA，反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环，取3次的平均值。

1.4观察指标 比较冠心病组、对照组的血清肌酸激酶(CK)、血清CK同工酶(CK-MB)、血清肌钙蛋白(cTn)I水平。

1.5统计学分析 采用SPSS22.0软件行t检验。

2 结 果

2.1两组外周血内皮祖细胞增殖、迁移、黏附能力比较 冠心病组外周血内皮祖细胞数目、迁移能力、增殖能力、黏附能力与对照组相比显著下降(均P<0.01)，见表1，图1。

图1 两组激光共聚焦显微镜检查Dil-acLDL及FITC-UEA-I染色双阳性(×200)

表1 两组外周血内皮祖细胞数目、增殖、迁移、黏附能力比较个)

2.2两组外周血内皮祖细胞miRNA表达水平比较 冠心病组外周血中内皮祖细胞miRNA-21、mi-RNA-150表达水平显著高于对照组(P<0.01)，见表2。

表2 两组外周血内皮祖细胞miRNA表达水平比较

2.3两组血清CK、CK-MB、cTnI水平比较 冠心病组的血清CK、CK-MB、cTnI水平与对照组比较显著降低(P<0.01)，见表3。

表3 两组CK、CK-MB、cTnI水平比较

3 讨 论

心肌细胞凋亡的直接因素之一为心肌缺血，大量研究发现miRNA-21在心肌缺血再灌注损伤和心肌细胞凋亡中发挥着重要的作用〔4，5〕。预处理或热休克可诱导miRNA-21表达，促使心肌梗死面积显著下降，说明miRNAs介导的心肌细胞保护机制中起到主要作用的是内皮诱导型一氧化氮合成酶、热休克蛋白70〔6，7〕。有研究〔8〕检测心肌梗死患者心肌组织标本的miRNAs表达水平，发现心肌梗死部位的内部区域miRNA-21表达水平下降，而边缘区miRNA-21显著升高。在健康人中，心脏miRNA-21呈现低水平表达，但在心脏缺氧缺血、心肌肥厚、心衰患者中miRNA水平显著上升〔9〕。研究发现，miRNA可对L-型钙通道蛋白表达水平进行负性调节，细胞内的Ca2+浓度显著下降，对心肌细胞肥大产生抑制作用。冠心病的开始环节为破坏了内皮系统，维持内皮的完整性可避免恶性心血管事件的发生，激活炎性反应下段通路〔10，11〕。

本研究结果与叶小林等〔12〕的结果大体一致，miRNA配对靶基因的进程主要为：(1)对靶基因翻译编码蛋白质的抑制产生抑制或降解作用；(2)对靶基因的半衰期进行改变；(3)进入细胞核，在转录水平对靶基因的表达进行沉默调控。miRNA可调控代谢酶、脚手架蛋白、信号蛋白、转录因子等靶基因，在调控代谢网、蛋白质相互作用网、转导细胞信号网、调控基因网等生物分子网络中起到关键作用。同时修复血管内皮，血管内皮受损后可经由内皮祖细胞进行再生分化，促使受损血管快速形成血管再内皮化，抑制冠心病的病理进程。修复受损内皮的内皮祖细胞过程是一个较为复杂的归巢过程，在基质细胞源性因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子等各种生长因子的作用下，内皮祖细胞由骨髓中向外周血中动员，并向内皮的受损部位进行迁移、黏附，在局部发生分化、存活、增殖，经由旁分泌、融合、整合等方式在修复血管内皮中发挥重要作用〔13,14〕。

综上，冠心病患者外周血中内皮祖细胞的数目较少，生成血管能力、迁移、黏附、增殖能力损伤，表达多种miRNA水平差异显著。