血清miR-1228-3p和miR-369-3p水平与非小细胞肺癌患者预后的关系

袁亚迪，张海涛，王乐朋，李丽，文璐，刘玉

(1.都江堰市人民医院呼吸内科，四川 都江堰 611830；2.巴音郭楞蒙古自治州人民医院呼吸与危重症医学科监护病区，新疆 库尔勒 841000；3.彭州市人民医院呼吸与危重症医学科，四川 彭州 611930；4.四川大学华西医院肿瘤科，四川 成都 610041)

肺癌按组织病理学可分为小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC占肺癌的75%，NSCLC包括腺癌、鳞癌、大细胞癌与腺癌混杂亚型等[1]，尽管肺癌的靶向治疗等新治疗方案取得了重大进展，但仍有70%肺癌患者在确诊时处于晚期或已发生远处转移，因而寻找新的治疗靶标及预后生物标志物迫在眉睫[2]。微小RNA(micro RNA,miRNA)为一种长度约21～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，成熟的miRNA为一段有发夹结构的单链RNA前体剪切后形成，miRNAs为涉及基因转录后调控的非编码RNA片段，存在多种形式，可调控RNA降解、抑制翻译起始过程，对靶基因发挥负性调控作用，miRNAs在生物体中参与细胞分化、增殖及凋亡等生物过程[3]。miR-1228-3p、miR-369-3p作为重要的miRNA，可促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移，与乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌等多种癌症密切相关[4]，但关于血清miR-1228-3p、miR-369-3p与NSCLC的关系及对其预后的预测价值报道甚少，本研究拟探讨血清miR-1228-3p、miR-369-3p与NSCLC患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年5月至2019年5月都江堰市人民医院收治的NSCLC患者106例，记为恶性组，纳入标准：(1)符合NSCLC诊断标准[5]，均经手术确定病理类型为腺癌及鳞癌，且收集血液标本前无化疗史或放疗史；(2)肿瘤淋巴结转移分期(tumor node metastasis classification，TNM)为Ⅱ～Ⅳ期；(3)完成1年的随访，生存资料完整可供分析。排除标准：(1)合并其他部位恶性肿瘤或既往有恶性肿瘤史；(2)收集血液标本前有肺部手术史或放化疗史；(3)临床资料不完整，未满足1年随访即脱落者。另将同期入院的肺部良性病变者40例纳入良性组，患者临床资料收集、标本采集均获得其知情同意。恶性组中，病理类型：腺癌56例，鳞癌50例；分化程度：低分化38例，中分化40例，高分化28例；TNM分期：Ⅱ期36例，Ⅲ期36例，Ⅳ期34例；临床分期：Ⅱ～Ⅳ期，Ⅰ期10例，Ⅱ期29例，Ⅲ期34例，Ⅳ期33例。良性组中，慢性肺炎21例，支气管肺炎11例，肺结节5例，肺气肿3例，均经肺部影像学及病原体检测等确诊。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 miR-1228-3p、miR-369-3p水平的测定 (1)血样采集：抽取入组对象6 mL外周血送外检，以miRNA快速提取试剂盒(Hai Gene公司)提取总miRNA，并应用NanoDrop进行RNA定量与质检；(2)应用加尾法逆转录miRNA为cDNA，首先以polyA聚合酶将polyA尾添加至0.5 μg总RNA中，后以M-MLV cDNA第一链逆转录试剂盒(盛科博源)将miRNA逆转录为cDNA；(3)实时荧光定量PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-qPCR)：应用miR-1228-3p、miR-369-3p SYBR Green miRNA荧光定量PCR试剂盒(上海联迈生物，货号：LM0005)于ABI 7500仪器上进行PCR反应，实验重复3次。方法：将逆转录得到的1μL cDNA加入至含10 μL 2×SYBR mix与0.2 μmol/L正向引物及反向引物的20 μL qPCR mix中。U6上游引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，扩增片段长度89 bp，miR-1228-3p上游引物为5’-TCAGTGCATCACAGAACTTTGT-3’，扩增片段长度125 bp，下游引物为5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；miR-369-3p上游引物为5’-CTTGACATGATTAGCTGGCATGATT-3’，下游引物为5’-CCTGTGCAATATGCCGTGTAGA-3’，扩增片段长度174 bp。PCR于ABI 7500实时PCR系统中进行，预变性95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s(40个循环)，60 ℃ 1 min(1个循环)。将所有样品以人U6基因表达量为内参，对RT-qPCR产物的细胞拷贝数进行标准化(目标miRNA△△Ct值=目标miRNA的Ct值-同一样本外参Ct值)，△△Ct=实验组△Ct-对照组△Ct，应用2-△△Ct计算相对表达量，所有反应均进行3次后计算相对表达水平。

1.2.2 资料收集 收集NSCLC患者临床资料，包括性别、年龄、吸烟史、病理类型、肿瘤分化程度、肿瘤分期、肿瘤大小、有无远处转移等，分析miR-1228-3p、miR-369-3p水平与NSCLC患者临床病理参数的关系。同时记录入院时血清肿瘤标志物[癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC-Ag)]，采用化学发光法检测血清CEA、CA125、YFRA21-1、SCC-Ag，参考范围：CEA 0～5.0 μg/L，CA125 0～25.0 U/mL，CYFRA21-1 0～3.3 ng/mL，SCC-Ag 0～1.5 μg/L。分析miR-1228-3p、miR-369-3p水平对NSCLC患者预后的预测价值。

1.2.3 随访及预后分析 经电话、邮寄、复查等方式进行随访，末次随访时间为2019年12月1日，每3个月随访1次，对有症状者予以相应检查，随访期间复查(如病史询问、体格检查、胸部CT等)，记录其预后情况。依据随访1年内预后情况将其分为存活组、死亡组，比较两组入院时血清肿瘤标志物并分析预测价值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组血清肿瘤标志物及miR-1228-3p、miR-369-3p水平比较

恶性组血清CEA、CA125、CYFRA21-1、miR-1228-3p、miR-369-3p水平均高于良性组(P<0.05)；两组SCC-Ag水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组血清肿瘤标志物及miR-1228-3p、miR-369-3p水平比较

2.2 miR-1228-3p、miR-369-3p水平与NSCLC患者病理参数的关系

NSCLC中，腺癌患者miR-1228-3p表达水平高于鳞癌，肿瘤分期Ⅳ期患者miR-1228-3p、miR-369-3p表达水平高于肿瘤分期Ⅱ～Ⅲ期者，肿瘤大小≥3 cm者miR-1228-3p表达水平高于肿瘤大小<3 cm者，有远处转移者miR-1228-3p、miR-369-3p表达水平高于无远处转移者(P<0.05)。不同性别、年龄、吸烟史、肿瘤分化程度患者miR-1228-3p、miR-369-3p表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 miR-1228-3p、miR-369-3p水平与NSCLC患者病理参数的关系

2.3 miR-1228-3p、miR-369-3p水平与NSCLC患者预后的关系

106例患者获得1年随访，20例在随访1年内死亡，死亡率为18.87%(20/106)。死亡组患者入院时血清CEA、CYFRA21-1、miR-1228-3p、miR-369-3p水平高于存活组(P<0.05)；两组CA125、SCC-Ag水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 miR-1228-3p、miR-369-3p水平与NSCLC患者预后的关系

2.4 miR-1228-3p、miR-369-3p水平对NSCLC患者预后的预测价值

ROC曲线显示，miR-1228-3p、miR-369-3p预测NSCLC患者预后的曲线下面积优于CEA、CYFRA21-1。见表5及图1。

表5 miR-1228-3p、miR-369-3p水平对NSCLC患者预后的预测价值

3 讨论

肺癌无典型临床表现，被确诊时多处于晚期，患者5年生存率低于20%，目前肺癌的诊断主要采用CT、血清肿瘤标志物检测、痰细胞学检查等无创检查手段，但CT检查有费用高、电离辐射、假阳性率高等缺点，因而寻找相对无创、更安全及敏感性与特异性更高的标志物对NSCLC的诊断尤为重要[6]。miRNAs除在细胞内发挥作用外，也存在于体液中，以从裂解细胞中被动释放、经囊泡的主动释放、以非囊泡形式主动分泌三种方式产生，miRNAs与mRNA进行碱基配对在各种生物过程如炎症、DNA修复、氧化应激反应、细胞生长与凋亡、基因表达与转录后调控等方面发挥作用[7]。miR-1228-3p、miR-369-3p是近年来发现的、参与多种疾病过程的重要miRNA。

本研究显示，恶性组血清CEA、CA125、CYFRA21-1、miR-1228-3p、miR-369-3p水平高于良性组，相比于肺部良性病变，NSCLC患者血清miR-1228-3p、miR-369-3p水平呈高表达。miR-1228-3p位于12号染色体的LRP1基因内，此基因主要涉及细胞代谢与细胞结构，也是维持细胞存活的关键组成部分。薛唯潇[8]研究表明，miR-1228-3p对NSCLC的早期诊断有重要意义，miR-1228-3p高表达的NSCLC患者中位生存期更短，miR-1228-3p高表达是NSCLC患者生存期的危险因素，说明miR-1228-3p可作为NSCLC诊断及预后评估的潜在标志物，本研究结果与之一致。Ogawa等[9]发现，miR-369-3p可抑制结直肠癌细胞的增殖及侵袭能力，通过敲低乳酸脱氢酶A的表达，而导致乳酸、三磷酸腺苷产生及葡萄糖的摄取减弱，减慢结直肠癌生长速度；Liu等[10]发现，miR-369-3p可通过自噬调节参与子宫内膜样腺癌病变发展。本研究也观察到，恶性组miR-369-3p相对表达量高于良性组，表明miR-369-3p在NSCLC发生发展中也有促进作用。第13届全国肺癌学术大会[11]也提出，人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中存在miR-369-3p过表达，且miR-369-3p在L9981细胞中的表达可能与L9981细胞的迁移能力及侵袭能力有关，miR-369-3p可能通过WSB1基因参与调节L9981的迁移与侵袭，而发挥调节NSCLC侵袭转移的作用，关于其机制可进一步进行研究。

miR-1228-3p、miR-369-3p主要经与mRNA的3’-UTR区域结合而产生直接降解靶基因或抑制其翻译的效应，从而在转录后水平密切参与调控基因的表达[12]，本研究发现，NSCLC中，病理类型、肿瘤分期、肿瘤大小、有无远处转移与患者miR-1228-3p表达水平有统计学差异，表明miR-1228-3p、miR-369-3p表达水平也与其病理进展有关，miR-1228-3p、miR-369-3p可能推进NSCLC的发生发展，促进其恶化与转移，监测miR-1228-3p、miR-369-3p对NSCLC有一定诊断和评估价值。

血清肿瘤标志物，如CEA、CYFRA21-1、SCC-Ag等是诊断NSCLC的常见标志物，但在NSCLC患者诊断及预后评估中敏感度与特异度不高[13]。本研究中，死亡组患者入院时血清CEA、CYFRA21-1、miR-1228-3p、miR-369-3p水平高于存活组，ROC曲线显示，miR-1228-3p、miR-369-3p预测NSCLC患者预后的曲线下面积优于CEA、CYFRA21-1，表明相比于传统血清肿瘤标志物，miR-1228-3p、miR-369-3p预测NSCLC患者预后效果更有优势。miRANs对30%人类基因有负性调控作用，miRNAs在生理条件下可调节各种生物途径，如细胞分裂、分化及凋亡等[14]，而miR-1228-3p、miR-368-3p分别为miR-1228、miR-369的成熟剪辑体之一，监测血清miR-1228-3p、miR-368-3p水平可较好推断NSCLC进展情况及肿瘤预后风险[15]。因此RT-PCR检测NSCLC患者血清miR-1228-3p、miR-369-3p水平可作为一种可行的液体活检手段，用于评估NSCLC患者预后。

综上所述，miR-1228-3p、miR-369-3p与NSCLC患者病理参数(病理类型、肿瘤分期、肿瘤大小、有无远处转移等)密切相关，可用于预测NSCLC预后，有望作为NSCLC管理的新型标志物。