S100A8对大鼠肺泡巨噬细胞炎性因子释放水平的影响

刘琴，杨陈武，刘小燕，欧国春，陈小菊

(1.川北医学院附属医院呼吸与危重症医学科，四川 南充 637000；2.成都大学附属医院呼吸与危重症医学科，四川 成都 610081；3.川北医学院附属医院医学影像研究所，四川 南充 637000；4.遂宁市中心医院呼吸与危重症医学科，四川 遂宁 629000)

S100A8是S100钙结合蛋白家族主要成员之一，在中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等髓系细胞中高表达[1]。在炎症反应中，S100A8由活化的巨噬细胞分泌，再与巨噬细胞、内皮细胞或淋巴细胞结合后发挥抗炎作用[2]。S100A8能够与脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)产生协同作用，放大LPS的促炎效应[3]。肺泡巨噬细胞是参与肺部炎症的重要细胞，S100A8呈剂量、时间依赖性刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)等炎症介质[4]。本研究拟探讨S100A8 siRNA对脂多糖诱导肺泡巨噬细胞释放各炎症介质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383购自中国科学院细胞库，S100A8 siRNA的构建及引物合成由上海生物工程科技有限公司完成。Ham’s F-12K基础培养基(Procell，中国)，胎牛血清(HyClone，美国)，青霉素-链霉素双抗(HyClone，美国)，LipofectamineTM2000(Invitrogen，美国)，脂多糖(Sigma，美国)，总RNA提取试剂Trizol(Invitrogen，美国)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，美国)，All-in-one qPCR Mix(GeneCopoeia，美国)，大鼠IL-6、IL-8和TNF-α ELISA试剂盒(NeoBioscience，中国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 NR8383细胞用含15%胎牛血清的Ham’s F-12K培养基于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染 转染当天取对数生长期的细胞，用6 cm皿进行细胞铺板，铺板细胞数为1.2×106个/6 cm皿，siRNA：LipofectamineTM2000=20 pmol：1.5 μL，转染步骤参照LipofectamineTM2000产品说明书进行。细胞转染分S100A8沉默组和阴性对照组：S100A8沉默组为S100A8-Rat-52 siRNA组，阴性对照组为转染无关序列siRNA组。转染后24 h收集细胞，平行试验进行3次。(1)S100A8-Rat-52 siRNA序列：正链：5’-GCAACGUCAUUGAAGUCUATT-3’；反链：5’-UAGACUUCAAUGACGUUGCTT-3’。(2)阴性对照siRNA序列：正链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；反链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.2.3 荧光定量PCR法检测目的基因表达水平 用Trizol法在超净环境中提取总RNA，均使用无菌无RNA酶器材。将总RNA逆转录为cDNA，PCR法对S100A8基因进行扩增，选择GAPDH为内参基因。大鼠S100A8基因引物序列：上游引物：5’-ACAGGGATGACTTCAGGAAAAT G-3’，下游引物：5’-CCACCCTTATCACCAACACAAG-3’，扩增片段长度：147 bp。大鼠GAPDH基因引物序列：上游引物：5’-AAGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物：5’-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG GTC-3’，扩增片段长度：115 bp。

逆转录及PCR均严格按照说明书进行，每个基因均为3个复孔。逆转录及PCR反应体系均为20 μL，逆转录条件为42 ℃、60 min，70 ℃、5 min。优化PCR反应程序：预变性95 ℃ 10 min；变性95 ℃ 10 s，退火62 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 15 s；扩增50个循环。用2-ΔΔCt法计算基因相对表达水平。

1.2.4 LPS刺激转染后细胞 分为S100A8沉默组和阴性对照(无关序列siRNA)组，siRNA片段成功转染细胞24 h后，细胞生长状态良好，收集细胞并以1×105的密度接种24孔板，每孔500 μL。用LPS刺激细胞，按照LPS刺激浓度，分为4组，分别加入稀释后的LPS至终浓度为10 μg/mL、1 μg/mL、0.1 μg/mL、0 μg/mL，完成干预后细胞继续放回细胞培养箱中培养。每个浓度均设置3个复孔。再继续培养2 h后，取出24孔板，分别收集以上各组细胞的上清液(4 ℃，1 500 rpm，离心5 min)，保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.5 细胞上清液中各细胞因子浓度的检测 ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-8和IL-6的浓度，实验按照ELISA试剂盒说明书进行。绘制ELISA标准曲线，通过曲线求得各样本的浓度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞转染效率观察

在倒置荧光显微镜下观察，带绿色荧光的细胞即为转染成功的细胞，转染率=同一视野绿色荧光细胞数/白光下细胞总数。本实验用siRNA：LipofectamineTM2000=20 pmol：1.5 μL转染NR8383细胞，转染效率>80%。见图1。

2.2 转染后NR8383细胞S100A8基因的沉默效率

转染24 h后检测S100A8基因的相对表达，S100A8-Rat-52 siRNA沉默组S100A8基因相对表达量为0.136(沉默率86.4%)。见图2。

2.3 不同浓度LPS刺激S100A8沉默组和阴性对照组细胞，上清液中炎症介质浓度的变化

增加LPS的刺激浓度，S100A8沉默组和阴性对照组细胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α浓度均逐渐增加，各浓度组与0 μg/mL的阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，各浓度组两两比较，差异也均有统计学意义(P<0.05)。见表1、表2、表3和图3。

表1 不同浓度LPS对S100A8沉默组和阴性对照组细胞分泌IL-6的影响

表2 不同浓度LPS对S100A8沉默组和阴性对照组细胞分泌IL-8的影响

表3 不同浓度LPS对S100A8沉默组和阴性对照组细胞分泌TNF-α的影响

以相同浓度LPS刺激S100A8沉默组和阴性对照组2 h，阴性对照组细胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的浓度均高于S100A8沉默组细胞的，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

3 讨论

在急性或慢性炎症反应中，活化的巨噬细胞可主动分泌S100A8[5]，而细胞外的S100A8可以与单核细胞、内皮细胞以及巨噬细胞等细胞表面的葡聚糖结合，激活Toll样受体4(toll-like receptors,TLR4)和晚期糖基化受体(receptors of advanced glycation endproducts，RAGE)等模式识别受体，继而发挥促炎作用[6-7]。S100A8可以激活单核细胞和巨噬细胞中的依赖核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路，使得TNF-α的产生和分泌增多，进一步放大炎症反应[8]。

LPS是G-细菌细胞壁的主要组成部分，可作用于肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞等，刺激细胞产生IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等炎症介质，是临床上炎症感染的主要因素[9]。本研究发现，予以不同浓度LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞NR8383，随着LPS浓度的增加，细胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α浓度均逐渐增加，提示LPS对肺泡巨噬细胞NR8383的刺激呈浓度依赖性，这与既往的研究[10]类似。

另外，本研究进一步成功沉默了NR8383细胞中的S100A8基因，再予以LPS刺激S100A8沉默组和阴性对照组细胞，阴性对照组细胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α浓度均高于S100A8沉默组，提示NR8383细胞中S100A8基因被沉默后，肺泡巨噬细胞受LPS刺激后释放的炎症介质IL-6、IL-8和TNF-α水平降低，这证实了脂多糖诱导的炎症反应与S100A8有着密切关系。LPS可能先诱导肺泡巨噬细胞产生S100A8，S100A8再刺激其产生炎症介质。既往研究[11-12]已证实脂多糖可诱导巨噬细胞产生S100A8，而S100A8可直接刺激离体培养的肺泡巨噬细胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α增多[4]。

综上，脂多糖呈浓度依赖性地刺激NR8383细胞分泌炎症介质IL-6、IL-8和TNF-α。LPS诱导的NR8383细胞内S100A8基因的表达降低后，IL-6、IL-8和TNF-α等炎症因子的水平也明显降低，即脂多糖诱导的炎症反应与S100A8密切相关。