苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因外显子7突变特点及临床研究

周怡，阙敏，王新静

(安徽省妇女儿童保健中心新生儿疾病筛查科，安徽 合肥 230061)

苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)为苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)基因突变导致常染色体隐性遗传病，多诱使肝脏PAH活性缺失或者降低，在我国发病率约为1/11 000[1]。PKU会严重影响儿童脑组织发育，未接受及时治疗会导致患儿出现语言、智力及运动功能障碍，且不可逆[2]。PKU按照血液中苯丙氨酸水平可以分为经典型、中间型以及轻型，其中近90%为经典型。不同国家、地区基因突变存在差异，因此不同地区基因突变特点存在差异[3]。PAH为发挥催化作用四聚体，可以将机体肝脏苯丙氨酸催化为酪氨酸，PAH基因存在12个内含子及13个外显子编码，其中外显子7与PAH酶活性功能关系密切[4]。因此，PAH基因外显子7突变种类、分布及特点在PKU患儿诊断发挥重要作用，也可以为患儿PAH基因突变具体机制的研究奠定基础。本研究通过采用聚合酶链反应-单链构象多态性(single strand Cconformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products，PCR-SSCP)及序列技术对PKU患儿进行检测，旨在明确PAH基因外显子7突变特点及其与临床的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月至2020年12月安徽省妇女儿童保健中心中心诊治的87例PKU患儿为研究对象。其中男性49例，女性38例；年龄0.7～7岁，平均(4.13±1.64)岁；依据苯丙氨酸水平分型：轻型(<600 μmol/L)8例，中间型(600～1 200 μmol/L)13例，经典型(>1 200 μmol/L)66例。纳入标准：(1)参照《高苯丙氨酸血症诊治共识》(2014年)中对应标准[5]进行诊断；(2)均接受了血二氢蝶啶还原酶、尿蝶呤谱、四氢生物蝶呤负荷试验；(3)初诊时苯丙氨酸水平超过120 μmol/L；(4)年龄0.7～7岁；(5)患儿研究参与获得其家属知情同意，研究进行符合《赫尔辛基宣言》中伦理学标准。排除标准：(1)酪氨酸血症、四氢生物蝶呤缺乏症、一过性高苯丙氨酸血症患者；(2)近期服用影响苯丙氨酸药物；(3)在入组前已经行对症治疗者；(4)存在心脏、肝肾、肺部等机体重要器官功能异常者。

1.2 方法

收集3 mL静脉全血，置于抗凝试管中待测。(1)DNA提取：应用QIAamp DNA Blood Mini Kit(德国Qiagen公司)抽提，DNA抽提浓度可以通过增加洗脱次数并延长高温孵育时间提高，获得基因DNA用1%琼脂糖电泳予以鉴定，将其置于-20 ℃保存待测。(2)PCR扩增：采用C1000 Touch型号PCR仪(美国Bio-Rad公司)完成。反应体系：1×缓冲液、dNTP、正向引物、反向引物、Taq酶、扩增反应模板、双蒸水体积分别为3、1、1、1、1、1、17 μL。PCR反应测定应用；反应条件：95 ℃预变性5 min→95 ℃变性45 s→60 ℃退火60 s→72 ℃变性45 s，30个循环后，72 ℃延伸10 min，随后将其温度降至4 ℃。应用1%琼脂糖电泳检测扩增PCR产物，将扩增产物置于-80 ℃冰箱保存待测。(3)DNA序列以及突变位点测定：应用PCR产物直接测序法进行检测，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司负责样品纯化以及序列检测，测序获得PAH基因DNA结果需要与基因库中对应结果予以比对，并依据基因库中结果确定外显子7突变情况。(4)基因型与PKU表型分析：依据Guldberg等[6]提出评分方式评估突变基因人为值(assigning value，AV)，其值与突变基因性质关系密切，AV值为1时表示存在突变，而残余酶活性范围低于10%、10%～30%、30%～70%及70%以上AV值分别赋分1、2、4、8分，最后将突变等位基因评分AV数值相加。依据AV数值之和预测患儿PKU表型，其中AV值之和为2、3～8及9以上分别表示为经典型、中间型及轻型PKU。

1.3 统计学分析

采用SPSS20.0软件对数据进行分析与处理。计数资料[n(%)]表示；基因型与PKU表型的预测价值应用Kappa检验。

2 结果

2.1 患儿PAH基因外显子7位点突变情况

87例患儿一共存在174个等位基因，最终检出6种PAH基因外显子7位点突变，其基因型分别为R243Q、IVS7+2T-A、R241C、G247R、L255S、G247V。见图1。

2.2 患儿PAH基因外显子7位点突变频率

87例患儿中，40例外显子7位点突变中检出1种基因突变，其中R243Q基因突变32例，IVS7+2T-A基因突变6例，R241C基因突变2例；4例中检出2种基因突变，其中R243Q/IVS7+2T-A基因突变1例，R241C/G247V基因突变1例，G247R/L255S基因突变2例。R243Q、IVS7+2T-A、R241C、G247R、L255S、G247V基因突变频率分别为18.97%、4.02%、1.72%、1.15%、1.15%、0.57%。见表1。

表1 患儿PAH基因外显子7位点突变频率[n(%)]

2.3 患儿PAH基因外显子7位点突变情况与表型的关系

经典型PKU患儿检出6种突变，中间型PKU检出R243Q、IVS7+2T-A、R241C三种突变，而轻型PKU仅检出R243Q突变。见表2。

表2 患儿PAH基因外显子7位点突变情况与表型的关系[n(%)]

2.4 患儿基因型-表型预测分析

应用外显子7位点突变情况预测患儿PKU表型，经典型、中间型及轻型PKU预测与临床诊断一致性较高，Kappa值分别为0.818、0.781、0.935。见表3。

表3 患儿基因型-表型预测分析

3 讨论

PKU主要由PAH基因突变所致，PAH基因主要由位于编码位置13个外显子及位于非编码位置12个内含子构成，可以发挥转录mRNA及翻译氨基酸作用。PAH基因亚基变化均会导致酶功能及结构变化，对应编码位置基因变化会进一步导致PAH功能降低或者缺失，进而使机体出现相应临床表现[7-8]。PAH基因外显子7主要存在于PAH酶催化区域，该区域存在氨基酸残基情况与活性位点关系密切，氨基酸碱基变化诱使PAH酶活性受到影响。因此，PAH基因外显子7是PKU患者PAH基因突变重要分析部分[9-10]。

本研究在PKU患儿体内发现6种PAH基因外显子7突变，分别为R243Q、IVS7+2T-A、R241C、G247R、L255S、G247V，6种基因突变频率分别为18.97%、4.02%、1.72%、1.15%、1.15%、0.57%。有研究[11]显示，84例患儿中共鉴定出159个PAH突变等位基因，包括100个错义突变、28个剪切突变、24个无义突变和7个缺失突变，外显子7突变频率最高(32.08%)，其中p.R243Q的突变频率最高，占全部突变的20.13%，与本研究结果一致。另一研究[12]显示，PAH基因中最常见遗传变异为c.1066-11G>A和c.143t>c，与任何单个外显子相比，外显子7携带遗传变异最多，3例患者PAH基因第7、11外显子c.727c>T/c.1066-11g>A杂合。本研究结果显示，大部分患儿均检出1种基因突变，且主要为R243Q基因突变，少部分患儿可以检出2种基因突变。国内研究者[13]也发现，PKU患儿中检出基因突变也为1种，且主要为第7号外显子，但是也发现1例典型病例出现2个杂合基因突变，主要为p.S70del(缺失突变)c. 208-210delTCT(缺失突变)，与本研究中相关结果相似。另研究[14]者发现，70例PKU患儿中大部分为复合杂合变异，仅有3例为纯合变异，原因可能是其研究中除检测外显子7号位点突变外，还检测了其他各种外显子以及内含子位点突变，但是本研究中仅检测了外显子7位点基因突变。对应基因型中变异位点相对温和位点即剩余酶活性高位点在基因突变中发挥主导作用，即其在基因型表型形成发挥决定作用[15]。经典型PKU患儿检出6种突变，中间型PKU检出R243Q、IVS7+2T-A、R241C三种突变，而轻型PKU仅检出R243Q突变，显示PKU患儿PAH基因突变基因型与患者临床表现存在相关性。本研究应用外显子7位点突变情况预测患儿PKU表型，经典型、中间型以及轻型PKU预测与临床诊断一致性较高，Kappa值分别为0.818、0.781、0.935，显示PAH基因型与临床诊断表型存在相关性，可用于患者临床表型诊断。Wang等[16]研究中，35例患儿中检出70个等位基因中鉴定出61个突变，频率为87.14%，最常见突变为R243Q(26.23%)、R241C(9.84%)和V399V(8.20%)，生化表型预测与临床表型一致性为81.25%，其中经典PKU的一致性最高(87.50%)。

综上，PKU患儿PAH基因外显子7位点突变有6种类型，其突变类型主要为R243Q，患儿临床表型与突变基因型存在相关性，突变基因型用于预测临床表型价值优异，可以为其后患儿诊断以及预后评价提供参考依据。但是基因突变容易受种族、地区等诸多因素影响，因此后期需要进一步扩大研究样本量，明确不同种族以及地区对PKU患儿PAH基因突变影响。