豆干黄浆水发酵条件优化及其作为酸浆豆腐凝固剂的应用研究

陈 斌 杨玥熹,2 李自成 沈聆清 李娟娟 顾振宇,2

(浙江工商大学食品与生物工程学院1，杭州 310018)(国家级食品工程与质量安全实验教学中心2，杭州 310018)

黄浆水是豆腐、豆干、千张等凝胶类豆制品生产时所产生的副产物，它含有丰富的营养因素，是一种天然的微生物培养基[1]。酸浆是由多种微生物共同发酵黄浆水得到的一种凝固剂[2]。在我国，酸浆用作豆腐凝固剂已超过40年，它除能沉降蛋白以外，更赋予豆制品独有的质构、醇香和生物活性[3]。在我国民间已有通过黄浆水自然发酵制取酸浆，进而用酸浆制作豆腐的工艺，制成的酸浆豆腐味道浓郁、口感佳，不引入重金属离子，是一种纯绿色食品，而且它还充分利用了黄浆水，保护了环境又物尽其用，值得深入研究和广泛推广[4-6]。有研究表明，利用酸浆点浆制成的豆腐在感官、保健性、出品率等方面都优于传统豆腐，同时提高了豆腐的保健功能[7]。但豆制品黄浆水发酵研究尚处于起步阶段，体系不完善；同时自发发酵的酸浆中菌种复杂，酸浆品质得不到保证，导致酸浆豆腐的生产存在问题。

黄浆水中含有多种有机酸，包括柠檬酸、苹果酸、酒石酸、醋酸、乳酸、富马酸、乙酸等[8]。它们不仅具有抑菌、利胆、消炎、降血糖、抗氧化以及调节机体免疫等作用[9]，而且能够增加冠状动脉血流量、抑制脑组织脂质过氧化物生成、软化血管、促进钙、铁元素的吸收，帮助胃液消化脂肪，预防疾病和促进新陈代谢[10]。经微生物发酵后有机酸含量会发生变化，影响酸浆豆腐的品质[11]。研究发现，自然发酵酸浆中乳酸菌是酸浆中的主要微生物，酸浆中的有机酸多为L-乳酸[12]。但是,目前对于黄浆水发酵前后有机酸变化研究较少。

本研究选用工业化菌种植物乳杆菌发酵黄浆水，通过发酵工艺优化，得到新型酸浆凝固剂，并用其替代传统豆腐凝固剂，研究适合于酸浆凝固剂发挥最佳效果的豆腐制备工艺参数，以提升豆腐品质，获得量产的酸浆豆腐产品，迎合当代消费者追求天然与健康饮食的观念。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆(产地：东北)、黄浆水、植物乳杆菌；富马酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、草酸均为优级纯。

1.2 仪器与设备

Agilent-1260-Infinity型高效液相色谱仪，INFINZTE-M-NA型酶标仪，SW-CJ-1FD型洁净工作台，Five Easy Plus pH计，Agilent-7890A型气相质谱色谱仪。

1.3 方法

1.3.1 植物乳杆菌的活化

吸取10 mL灭菌后的MRS液体培养基在无菌试管中，用无菌接种环蘸取适量的植物乳杆菌菌粉，接种在试管中，放置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h，传代3次，作为种子菌种备用[13]。

1.3.2 酸度的测定

参照GB 5009.239—2016的方法[14]。采用酚酞指示剂法测定黄浆水的酸度。

1.3.3 菌落总数的测定

参照GB 4789.2—2016的方法[15]，采用平板计数法测定黄浆水的菌落总数。

1.3.4 黄浆水发酵条件优化

以葡萄糖添加量(0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)、发酵温度(30、32、34、36、38 ℃)、初始pH(4.5、5、5.5、6、6.5)、接种量(2%、4%、6%、8%、10%)、发酵时间(24、36、48、60、72 h)为因素，分别考察上述因素对酸浆中活菌数和产酸量的影响，以确定最优的黄浆水发酵条件。

1.3.5 有机酸含量的测定

1.3.5.1 色谱条件

色谱柱：ZOPBAX Eclipse XDB-C18 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流动相条件：甲醇(A)，0.01 mol/L KH2PO4-HPO4(B)，用85%的磷酸调节pH=2.85；洗脱比例：A∶B=5∶95；流速：0.8 mL/min；波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

1.3.5.2 有机酸标准曲线的绘制

称取7种有机酸标准品，用流动相B液稀释成不同的倍数，放置于4 ℃冰箱中。

1.3.5.3 样品处理

准确吸取5 mL黄浆水样品，12 000 r/min下离心30 min。离心后，吸取1 mL上清液，使用0.45 μm滤膜过滤，置于样品瓶中，待测[16]。

1.3.6 酸浆豆腐的制备

挑选大豆100 g，豆水比为1∶4，在25 ℃条件下浸泡12 h，洗净，选择干豆与水的比为1:7磨浆，过滤后量取400 mL的豆浆煮浆，煮浆温度控制在95～100 ℃。煮浆后待温度下降到85 ℃，添加豆浆总量10%的酸浆凝固剂，缓慢加入，待出现大片豆花时停止搅拌，放入60 ℃恒温水浴锅中，保温30 min，然后放入模具中压制30 min。

1.3.6.1 凝固剂添加量

分别加入豆浆体积9%、10%、11%、12%的酸浆凝固剂，然后按照1.2.6的方法制作酸浆豆腐。

1.3.6.2 点浆温度

按照1.2.6的方法制作酸浆豆腐，酸浆豆腐凝固剂的添加量为豆浆体积的10%，控制点浆温度为75、80、85、90 ℃。

1.3.6.3 磨浆料液比

按照干豆和水的比例1∶5、1∶6、1∶7、1∶8磨浆，然后按照1.2.6的方法制作酸浆豆腐。

1.3.7 酸浆豆腐品质评价

1.3.7.1 豆腐持水率的测定[17]

称取约2 g新鲜豆腐，记录质量为W1，将其置于底部有脱脂棉的50 mL离心管中，以3 000 r/min的转速离心10 min后并称重，记录质量为W2，然后将样品置于105 ℃烘箱中干燥6 h后称重，质量记为W3，豆腐持水率按公式计算。

持水率=(W2-W3)/(W1-W3)×100%

1.3.7.2 豆腐色泽的测定

豆腐色泽指标的测定参考GB/T 12097—1989，使用全自动色差计测定色度(以L*，a*，b*值表示，用白板校准)，平行测定3次[18]。

1.3.7.3 豆腐全质构(TPA)和凝胶强度的测定

参考李玉娥等[19]的方法并略作修改，将酸浆豆腐切割成2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm的立方块，置于测试平台上。采用TPA模式进行豆腐的质构分析，测定参数是：探头型号P/0.5，测前速度1 mm/s，测中速度1 mm/s，测后速度1 mm/s，应变30%，时间5 s，触发类型：auto，触发力：5 g。样品平行测定3次。凝胶强度的测试参数将TPA模式中应变30%改为最大位移15 mm，其他条件不变，凝胶强度定义为凝胶破裂所需应力(g)。

1.3.7.4 酸浆豆腐微观结构的测定

参考Liang等[20]的方法，将豆腐凝胶切成约1.5 mm的厚薄片，置于的2.5%戊二醛溶液(0.1 mol/L pH=7.4的磷酸缓冲液配置)中固定的36 h。然后经磷酸缓冲液漂洗3次，每次10 min，再用体积分数为30%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇对样品进行梯度脱水，每次20 min，然后用无水乙醇脱水2次，每次30 min。脱水后的样品经叔丁醇置换2次，每次30 min。最后样品经液氮预冷冻后，进行真空冷冻干燥，然后进行离子溅射喷金处理，最后用SEM对断面结构进行观察。

1.3.7.5 酸浆豆腐感官评定

感官评价小组由7名熟悉感官评价的食品专业学生组成，分别对豆腐样品进行打分，各项指标满分为10分，感官得分最终以加权平均分表示[21]。感官评价评分标准如表1所示。

表1 酸浆豆腐感官评定打分表

豆腐加权得分=风味得分×10%+口感×20%+色泽×20%+表观结构×20%+总体可接受性×30%。

2 结果和分析

2.1 黄浆水发酵条件优化

由图1a所示，随着葡萄糖添加量的增加，体系的酸度显著升高，当葡萄糖添加量为0.6%时，酸度达到最大值60oT。随着发酵温度的升高，酸度的升高也呈现显著性，在发酵温度达到34 ℃时，酸度达到最高值。酸度随着pH升高呈现出明显下降的趋势，在pH为6.5时酸度最小。微生物接种量对酸度无极显著的影响，在接种量为8%时，该条件下的酸度达到最大值。随着时间的延长，酸度整体呈现增长的趋势。

发酵条件对酸浆中活菌数的影响如图1b所示。当葡萄糖添加量到达0.6%时，活菌数达到最大值，有研究表明，碳源增加会促进微生物的生长，但是碳氮比要在一个合适的范围内，之后再继续增加碳源会使得微生物细胞的渗透压发生改变，降低微生物的出生率[22]。在温度达到36 ℃时，微生物不再生长且达到最大值。活菌数随着pH的升高呈现先增大再减小的趋势，在pH为4.5时，活菌数最小，可能因为pH过低，抑制了微生物的生长，继续增加pH为5时，活菌数到达最大值。随着发酵时间的增长，活菌数则表现出逐渐下降的趋势，时间越长，培养基中的营养物质越少，同时，植物乳杆菌的稳定期为发酵12 h左右，之后就会出现衰亡率大于出生率，使得整体微生物呈现衰亡现象。

图1 发酵条件对黄浆水酸度和菌落数的影响

2.2 正交实验

根据单因素实验结果，进行正交实验。其因素水平见表2，参考石道函等[23]的方法，使用综合评分法来确定最终的实验结果，综合评分结果见表3。

表2 正交实验因素水平表

表3 正交实验综合评分表

由表4可知，五个因素对黄浆水发酵后酸度和菌落数的影响程度依次是葡萄糖添加量>发酵时间>接种量>初始pH>发酵温度。植物乳杆菌发酵豆干黄浆水的最优组合为A3B2C3D3E2,即葡萄糖添加量0.8%，初始pH5.5、接种量8%、发酵时间48 h，发酵温度34 ℃。

表4 综合结果极差分析表

2.3 黄浆水发酵前后有机酸含量的变化

黄浆水经植物乳杆菌发酵后，有机酸总量有显著性升高。这与发酵过程中黄浆水的pH值逐渐下降是一致的。从表5中可以看出，植物乳杆菌发酵黄浆水过程中主要产生了乳酸。通过比较发酵前和发酵后的有机酸含量，乳酸含量由(16.26±0.09)μg/mL升高到(865.31±0.04)μg/mL。乙酸含量由(190.61±0.02)μg/mL降低为(76.58±0.05)μg/mL，这可能因为乙酸在黄浆水发酵过程中转换成了醇类或者醛类等其他物质。

表5 黄浆水发酵前后7种有机酸含量变化

2.4 酸浆豆腐点浆工艺研究

如图2所示，当改变点浆温度时，豆腐持水性和凝胶强度的变化趋势呈现一致性。当点浆温度在85 ℃时，豆腐持水性和凝胶强度都达到最大，且与其他温度条件下有显著性差异。原因是由于温度升高过程中，豆浆蛋白质会暴露出更多的巯基基团，促进二硫键的交联，使得蛋白质的网状结构更加紧密，增加蛋白质的凝胶强度，但是温度太高会使得巯基氧化现象越来越严重，对凝胶强度和持水性产生负面影

图2 不同条件酸浆豆腐持水率和凝胶强度的影响

响[24-26]。随着凝固剂的添加量的增加，豆腐的凝胶强度出现先增加再减少的趋势，当凝固剂添加量为10%时，豆腐持水性和凝胶强度显著性升高。主要是因为凝固剂添加量的增加可以增强蛋白质间的疏水作用，氢键间的相互作用力加强，导致蛋白之间的凝胶强度加大。但是凝固剂的添加量如果过大，会使得蛋白质的酸化速率过快，此时的蛋白质的凝胶网路结构就会比较差[27]。随着水豆比的增加，豆腐的凝胶强度和持水性总体呈现逐渐降低的趋势，当水豆比为8时与其他组别有显著性差异(P< 0.05)。

2.5 酸浆豆腐品质评价

2.5.1 质构特性和色泽

从表6中可以看出，市售酸浆豆腐和试制酸浆豆腐除了弹性指标无显著性差异，其余各项指标二者之间都具有显著性差异，并且市售豆腐的指标远远大于试制酸浆豆腐。试制酸浆豆腐的白度和市售酸浆豆腐无显著性差异，市售豆腐的色泽更偏绿偏黄。

表6 酸浆豆腐质构和色泽

2.5.2 微观结构

如图3所示，二者之间的蛋白凝胶网状结构明显不同，市售酸浆豆腐的网状结构更为细致紧密，所以蛋白凝胶强度比较大，试制酸浆豆腐的凝胶网状结构比较粗糙，但蛋白间的空洞比较小。

图3 酸浆豆腐的扫描电镜图

2.5.3 感官分析

从图4可以看出，市售酸浆豆腐的风味较好，可能的原因是市售酸浆豆腐由自然发酵的酸浆制成，风味物质比较多，但是试制酸浆豆腐的表观结构以及口感还有总体可接受性分数明显高于市售酸浆豆腐，结合质构与色差结果综合分析可知，豆腐的总体接受度与其凝胶强度不成正相关。

图4 酸浆豆腐的感官分析

3 结论

本研究通过单因素和正交实验优化黄浆水发酵工艺，最佳条件为：葡萄糖添加量0.8%，初始pH 5.5、接种量8%、发酵时间48 h，发酵温度34 ℃。发酵后，酸浆中有机酸含量显著升高，其中乳酸和乙酸变化最为明显。与市售豆腐相比，试制酸浆豆腐凝胶强度和持水性较大，凝胶微观结构空隙大，试制酸浆豆腐的感官品质稳定，表观结构、口感以及总体可接受性高于市售酸浆豆腐。本研究利用植物乳杆菌发酵黄浆水作为凝固剂制备酸浆豆腐不仅能够提升豆腐品质，迎合当代消费者追求天然与健康饮食的观念，而且还能减少黄浆水排放，降低生产成本，提高豆制品生产企业综合效益和竞争力。