谭超超,王衡新
(1湖南省人民医院检验科,长沙 430005;2天地恒一制药股份有限公司,长沙 410331)
急性胰腺炎(acute panereatitis,AP)是临床上常见的消化系统疾病,病因复杂,发病率呈现逐年上升的趋势,严重威胁着人民群众的生命健康[1-4]。其中,重症急性胰腺炎(severe acute panereatitis,SAP)的死亡率高达20%,而继发感染是重症急性胰腺炎致死致残的主要原因之一,因此,如何有效地控制SAP的继发感染是临床改善患者预后的关键。
大量的临床资料及动物实验研究证实,SAP的继发感染是由肠道细菌及其代谢产物易位所引起,肠道是上述感染发生的主要场所,而感染的起因就是肠黏膜屏障功能障碍[1-4]。肠道正常菌群是肠道黏膜屏障的重要组成部分,在维持肠道黏膜屏障功能上起着至关重要的作用[5]。肠道微生态失衡、肠道黏膜屏障功能障碍是急性胰腺炎病情加重和复杂化的重要原因。本研究构建AP大鼠动物模型,通过益生菌阻止肠道屏障功能障碍,减少肠道细菌易位感染,进一步明确肠道菌群在急性胰腺炎易位感染中的重要作用,从恢复肠道屏障功能和重建肠道菌群微生态角度,为防治急性胰腺炎继发感染提供新思路。
1.1 实验动物32只6周龄的SD大鼠,体重300 g左右(所有大鼠均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司),生产许可证号:SCXK(湘)2019-0004,使用许可证号:SYXK(湘)2020-0017。
1.2 主要试剂与仪器益生菌双歧杆菌及乳酸杆菌(内蒙古双奇药业股份有限公司),细菌基因提取试剂盒及荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,qPCR)试剂盒(中国大连Takara),牛黄胆酸钠(Sigma公司),内毒素检测试剂盒(厦门市鲎试剂实验厂有限公司)。D-乳酸以及二胺氧化酶检测试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司),血清炎症因子检测试剂盒(Invitrogen公司)。
1.3 急性胰腺炎动物模型的复制及动物分组将上述SD大鼠随机分为4组,每组8只,分别为假手术组(对照组),急性胰腺炎组(模型组),急性胰腺炎益生菌组(益生菌组)以及急性胰腺炎益生菌对照组(益生菌对照组)。益生菌组大鼠术前灌胃喂养2.5×109CFU/d的双歧杆菌及乳酸杆菌制成的微生态制剂,2 d。其他各组灌胃喂养等份量玉米粉及淀粉等混制的安慰剂,其他处理一致,无菌条件下进入腹腔,对模型组、益生菌组、益生菌对照组分别逆胆管注射 5%牛黄胆酸钠(1mL/kg),速度 0.2 mL/min。3 min后可见胰腺区弥漫性充血肿胀,观察5 min后缝合关腹[6];假手术组注射等量无菌生理盐水,4组均于实验动物中心饲养,温度控制在(22±2)℃,自由进食进水,昼夜明暗交替,各组大鼠于术后24 h处死,取标本。所有实验均遵照实验动物保护条例和相关的实验动物伦理委员会的伦理学标准。
1.4 肠道优势菌群分析所有实验动物在构建模型成功后24 h,在严格无菌操作下,取小肠内容物1~3 g,提取细菌基因组总DNA,根据试剂说明书要求(中国大连Takara)进行粪便优势菌qPCR法检测。具体操作参考Tan等方法进行,细菌特异性引物组和用于qPCR的反应条件按照Tan文献[3]报道设定,所有反应均重复进行3次,细菌数量单位以每克粪便(湿重)的log10(简写为lg)细菌数表示。
1.5 细菌易位感染及病理检测所有实验动物在构建模型成功后24 h,在严格无菌操作下,取肝脏左叶组织、脾脏、肾脏和肠系膜淋巴结(MLN),在含无氧缓冲液的无菌研磨器中制成10%匀浆,30 min内取组织匀浆接种于普通血平板和厌氧血平板上,37℃分别在需氧和厌氧条件下培养,计数菌落,以组织匀浆中培养出菌落即为细菌易位感染阳性。同时取胰腺组织进行HE染色组织病理学观察。
1.6 肠道黏膜通透性和血清炎症因子水平的检测所有实验动物在构建模型成功后24 h,处死取血3 mL,3 000 r/min离心10 min,取血清用于内毒素、肠道通透性相关指标D-乳酸以及二胺氧化酶以及炎症因子白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-α)测定。其中内毒素水平采用鲎试验法进行检测(厦门市鲎试剂实验厂有限公司)。D-乳酸以及二胺氧化酶水平均采用分光光度法检测(上海杰美基因医药科技有限公司)。血清炎症因子采用酶联免疫吸附法(Invitrogen炎症因子ELISA试剂盒)测定。
1.7 统计学分析所有数据建库、分析均采用SPSS 18.0软件。正态分布的连续变量数据采用均数±标准差(±s)表示。组与组之间比较采用t检验,不同指标之间相关性分析采用Pearson相关系数分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组大鼠病理及易位感染分析结果对照组大鼠胰腺病理HE染色切片显示大鼠胰腺组织结构清晰,无炎性细胞浸润。模型组大鼠胰腺宽稀,组织结构坏死,可见大量炎性细胞浸润。益生菌组胰腺大部分组织结构清晰,可见少量炎性细胞浸润,严重程度较模型组显著减轻。而益生菌对照组胰腺组织病理改变比益生菌组坏死及炎性浸润更严重,与模型组比较接近(图1)。细菌易位感染培养结果显示对照组无易位感染,模型组6只细菌培养阳性,易位感染发生率为(75%),益生菌组及益生菌对照组发生率分别为12.5%和87.5%。益生菌组易位感染率显著低于模型组(F=6.35,P=0.01)以及益生菌对照组(F=9.00,P<0.01)。
图1 各组大鼠胰腺组织病理学改变
2.2 各组大鼠肠道菌群qPCR结果荧光定量PCR分析结果显示益生菌组乳酸杆菌(8.59±0.96)lg拷贝数/g、双歧杆菌(8.36±0.89)lg拷贝数/g,显著高于模型组乳酸杆菌(6.85±0.68)lg拷贝数/g、双歧杆菌(5.68±0.78)lg拷贝数/g及益生菌对照组乳酸杆菌(6.78±0.74)lg拷贝数/g、双歧杆菌(6.02±0.85)lg拷贝数/g。而益生菌组肠球菌(7.05±0.67)lg拷贝数/g、肠杆菌(8.05±0.86)lg拷贝数/g显著低于模型组肠球菌(8.69±1.05)lg拷贝数/g、肠杆菌(9.86±0.89)lg拷贝数/g及益生菌对照组肠球菌(8.74±0.86)lg拷贝数/g、肠杆菌(9.68±0.85)lg拷贝数/g(图2)。
图2 急性胰腺炎肠道优势菌群分析
2.3 各组大鼠肠道通透性及炎症因子水平比较各组大鼠肠道黏膜通透性和炎症因子的检测结果显示益生菌组内毒素、二胺氧化酶、D-乳酸水平、IL-6及TNF-ɑ水平显著低于模型组及益生菌对照组(表1)。
表1 各组大鼠肠道黏膜通透性和炎症因子的检测结果(±s)
表1 各组大鼠肠道黏膜通透性和炎症因子的检测结果(±s)
注:与对照组比较,*P<0.05,与模型组比较,#P<0.05,与益生菌组比较,&P<0.05。
组别内毒素/(EU/mL)二胺氧化酶/(ku/L)D-乳酸/(mmol/L)IL-6/(pg/mL)TNF-ɑ/(pg/mL)对照组(n=8)0.10±0.041.27±0.958.05±2.3211.35±5.3615.65±6.98模型组(n=8)益生菌组(n=8)0.62±0.18*0.40±0.15*#6.85±2.15*4.35±1.68*#13.65±4.25*8.65±5.20*#56.85±13.58*35.65±11.24*#44.69±14.36*34.25±9.68*#益生菌对照组(n=8)6.58±1.85*&0.68±0.12*&14.35±4.23*&53.65±13.25*&42.25±9.87*&
2.4 肠道优势菌群与肠道黏膜通透性及炎症因子水平的相关性分析Pearson相关分析结果显示:肠球菌、肠杆菌均与内毒素、肠道通透性指标二胺氧化酶活性、D-乳酸含量及炎症因子IL-6呈正相关,其中肠杆菌与二胺氧化酶相关强度最大(r=0.51,P=0.00),双歧杆菌、乳酸杆菌与二胺氧化酶活性、D-乳酸含量及炎症因子IL-6呈负相关,其中双歧杆菌与内毒素负相关强度最大(r=-0.56,P=0.00)(表2)。
表2 肠道优势菌群与肠道黏膜通透性及炎症因子水平的相关性分析
肠道是引起急性胰腺炎继发感染的细菌的主要来源[5,7-8]。SAP时,肠道菌群微生态平衡被破坏,导致肠道黏膜屏障功能障碍,通透性显著增加,是肠道细菌发生易位感染的重要原因[5,9-11]。前期研究提示急性胰腺炎易位感染患者肠道菌群发生显著改变,易位感染患者正常菌群数量减少,肠道致病菌大量繁殖[3,12]。本研究的肠道微生态制剂根据急性胰腺炎肠道菌群的改变而制成,有助于重建肠道菌群微生态平衡。
本研究通过逆胆管注射牛胆磺酸钠构建急性胰腺炎动物模型,同时应用微生态制剂恢复肠道菌群,研究结果证实益生菌有助于恢复肠道菌群微生态平衡,益生菌组易位感染发生率较模型组降低62.5%。。本研究实时荧光定量检测肠道优势菌群发现,急性胰腺炎模型组大鼠肠道内双歧杆菌属细菌、乳杆菌属细菌明显减少,致病菌肠杆菌科细菌、肠球菌等均明显升高。而益生菌灌胃喂养可著增加肠道内双歧杆菌属细菌、乳杆菌属细菌,控制致病菌肠杆菌科细菌、肠球菌增殖。此外病理分析结果也提示益生菌有助于减轻急性胰腺炎严重程度,可显著降低肠道细菌易位感染。
二胺氧化酶、内毒素和D-乳酸是评价肠道黏膜通透性变化及屏障功能损伤状态的常用指标,其水平升高表明肠道黏膜屏障受损,通透性增大。为了进一步明确益生菌对肠道菌群及急性胰腺炎的调控作用,本研究对各组SD大鼠急性胰腺炎肠道通透性及炎症因子进行了分析,研究结果显示益生菌组内毒素、二胺氧化酶、D-乳酸水平、IL-6及TNF-ɑ水平显著低于模型组及益生菌对照组,结果提示益生菌有助于维护肠道黏膜屏障,从而控制急性胰腺炎炎症的发生发展及疾病进展。
本研究结果显示:肠球菌、肠杆菌与内毒素、二胺氧化酶活性、D-乳酸含量及炎症因子IL-6呈正相关,双歧杆菌、乳酸杆菌与二胺氧化酶活性、D-乳酸含量及炎症因子IL-6呈负相关。提示肠道菌群参与急性胰腺炎肠道屏障功能及炎症反应,通过微生态制剂可改善肠道微生态,从而控制疾病进一步进展和恶化。国内外多项研究均证明,在急性胰腺炎大鼠动物模型中,益生菌有助于阻止肠道屏障功能障碍,显著减少肠道致病菌的繁殖和肠道细菌易位感染,降低SAP死亡率[13-16]。提示,适时给予微生态制剂改善AP患者肠道菌群是临床控制SAP继发感染、降低SAP死亡率的有效措施之一。
综上所述,本研究初步证实益生菌有助于恢复急性胰腺炎肠道菌群生态,控制致病菌的增殖,改善肠道屏障功能,对控制急性胰腺炎进展、阻止肠道细菌易位感染都有重要的意义。