P-选择素基因-2123C＞G、-1817T＞C与房颤合并血栓的相关性研究①

马晓芸，哈尼克孜·买买提衣明，居勒德孜·海拉提，马尔加恩·巴克依，刘志强，木胡牙提

（1新疆医科大学第一附属医院干部保健中心，2新疆医科大学第一临床医学院暨第一附属医院，3新疆医科大学第一附属医院心脏中心综合心脏内科，乌鲁木齐 830054）

房颤患者并发血栓，会对其生存质量带来深远的影响[1-2]，对该疾病的病因进行分析与研究十分重要。研究显示，活化的血小板相关蛋白P-选择素与血栓性疾病相关，然而，国内外关于房颤合并血栓与P-选择素基因多态性的研究相对较少，并且存在一定的争议[3-4]。因此，本研究将探讨P-选择素基因-2123C＞G、-1817T＞C位点的基因多态性与房颤血栓形成的关联性。

1 资料与方法

1.1 研究对象纳入2011年8月-2020年6月间课题组流调、门诊就诊及住院患者和健康体检者，均已签署研究的知情同意书。研究对象分为房颤血栓组291例[其中男性168例，女性123例；平均年龄(60.77±12.40）岁]，房颤组534例[其中男性338例，女性196例；平均年龄(60.31±11.26）岁]，正常对照组981例[其中男性624例，女性357例，平均年龄(53.77±12.00)岁]。

1.1.1 纳入标准

1.1.1.1 房颤血栓组 （1）按照房颤指南定义[5]：无中-重度的二尖瓣狭窄或无机械性的心脏瓣膜的持续性房颤患者；（2）经十二导联的心电图，或者24小时的动态心电图、心脏超声诊断非瓣膜性心房颤动；（3）满足以下条件之一：a:经食道超声诊断左房内的血栓形成，或者左心房内的血流为泥沙样变化；b:结合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[6]的标准，经CT或MRI确诊为脑卒中者；（4）有自主知情能力，愿意参与研究者。

1.1.1.2 房颤组：（1）经过详细的病史询问及完善CT、MRI、超声等影像检查，除外血栓存在；（2）余同房颤血栓组。

1.1.1.3 正常对照组 （1）在本院健康管理中心进行体检的健康人群；（2）详细的病史询问，完善十二导联心电图，或者24 h动态心电图、CT、MRI、超声等影像检查，除外房颤及血栓存在；（3）有自主知情能力，愿意参与研究者。

1.1.2 排除标准 （1）不能按计划参加研究者；（2）合并有严重的瓣膜性的心脏病、免疫系统疾病（包括风湿性疾病）、各种急/慢性感染性疾病、慢性肝病、慢性肾病、恶性肿瘤、急性冠脉综合征等；（3）近期有口服避孕药物、利尿剂及其他药物等；（4）其他原因不符合纳入标准的。

1.2 内容与方法

1.2.1 血液样本收集 记录病史、年龄、性别、吸烟、饮酒的情况、体质指数、血压等。清晨抽取肘部静脉血5 mL（空腹），置于EDTA抗凝管中，放置在零下80℃的冰箱内备用。

1.2.2 实验方法 用基因组DNA提取试剂盒(天根生物技术有限公司，中国，北京)提取DNA。用Primer 5.0软件(Premier Biosoft International，Palo Alto，CA)设计rs1800807和rs1800808的引物（Sangon Biotech Co.中国上海）。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)进行基因分型，扩增程序：95℃预变 性 30 min，95℃ 变 性 30 s，54.7℃ (rs1800807)或56.6℃(rs800808)下退火30 s，然后在72℃延伸60 s，最后在72℃延伸5 min。PCR产物与核酸内切酶在37℃下孵育16 h，然后进行2%琼脂糖凝胶电泳，鉴定基因型。

1.3 统计学处理使用遗传平衡定律（Hardy Weinberg定律），P＞0.05提示样本具有群体代表性。应用SPSS 26.0统计软件，计量资料采用独立样本的t检验，计数资料则采用卡方检验，采用百分率（%）来表示计数资料占总体的比率，P＜0.05时差异具有统计学意义。Logistic回归模型分析基因模型与疾病之间的关联强度，P＜0.05认为模型具有统计学意义。使用Haploview软件分析基因的单倍体型。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验使用Hardy-Weinberg检验公式来分析各组的基因型频率，3组样本均具有群体代表性（P＞0.05），见表1、2。

表1 Hardy-Weinberg平衡检验（-2123C＞G）

表2 Hardy-Weinberg平衡检验（-1817T＞C）

2.2 P-选择素基因多态性在各组中的分析P-选择素的-2123C＞G位点和-1817T＞C位点的等位基因、基因型的分布、显性基因模型、隐性基因模型进行比较，3组之间的差异具有统计学意义（P均＜0.05）。具体基因型分布见表3。

表3 P-选择素-2123C＞G、-1817T＞C位点基因型、等位基因分布/n（%）

2.3 P-选择素基因多态性与房颤血栓相关性分析Logistic回归分析发现，房颤血栓组和房颤组比较，P-选择素基因-2123C＞G位点的各遗传模型P均＞0.05，差异无统计学意义，提示P-选择素基因-2123C＞G位点各遗传模型对房颤患者发生血栓作用不显著。P-选择素基因的-1817T＞C位点的各基因模型P＜0.05，提示模型有统计学意义。相对于携带-1817T＞C位点C等位基因，房颤患者携带T等位基因与血栓形成呈负相关（B=-0.400，OR=0.670，95%CI：0.542～0.829）；相对于携带CC基因型，携带TT基因型与血栓的形成呈 负 相 关（B=-0.891，OR=0.410，95%CI：0.259～0.651），携带CT基因型与血栓的形成呈负相关（B=-0.632，OR=0.532，95%CI：0.335～0.843）。房颤患者表现为显性遗传模型时，与血栓事件呈负相关（B=-0.396，OR=0.673，95%CI：0.504～0.899），表现为隐性基因遗传模型时，与血栓事件呈正相关（B=0.764，OR=2.147，95%CI：1.390～3.316），具体见表4。

表4 房颤血栓组、房颤组的基因型频率和等位基因频率的Logistic回归分析

2.4 P-选择素基因的单倍型分析本研究使用Haploview软件对P-选择素基因-2123C＞G（rs1800807）、-1817T＞C位点（rs1800808）进行单体型分析，排除频率小于3%的罕见单体型，分析P-选择素的-2123C＞G（rs1800807）、-1817T＞C位点（rs1800808）依次构成的单体型，有4种单体型的频率纳入分析，分别为CC、CT、GC、GT。在房颤血栓组和房颤组比较中，携CC（-2123C＞G/-1817T＞C）单体型优势比（OR=1.378，95%CI：1.047～1.814），GC 单体型优势比（OR=1.373，95%CI：1.059～1.781），提示 CC（-2123C＞G/-1817T＞C）、GC（-2123C＞G/-1817T＞C）单体型可能增加房颤患者血栓事件发生的风险，见表5。

表5 房颤血栓组、房颤组的-2123C＞G/-1817T＞C位点的单倍体分析

3 讨论

房颤作为心内科的常见病、流行病[7]，其严重的临床结局是血栓栓塞的形成，房颤患者并发左房的血栓，栓子可能脱落造成全身血栓栓塞，使致残率、致死率增高。在中国，房颤患者血栓发生的风险是非房颤患者的4～5倍，与各种原因相关的死亡风险是其他原因的2倍[8]。房颤患者并发脑卒中的几率每年为4.9%～6.9%，且与年龄的增加相关，临床上20%～30%的脑卒中归因于房颤[9-10]。胡大一等[11]的研究表明，中国人群中房颤合并脑卒中的患病率为24.81%。

目前房颤相关性血栓的发病机制仍未明确，有研究表明P-选择素基因存在多态性，且有地域的差异[12-13]。关于P-选择素基因多态性和疾病的关联性，国内外的研究大部分是和冠心病、心肌梗死、静脉血栓相关，P-选择素基因多态性和房颤的研究较少。前期本课题组研究发现P-选择素与房颤血栓发生相关[14-16]。曾国良[3]发现在非瓣膜性房颤患者中，存在P-选择素-2123C/G、-1817T/C基因的多态性，且P-选择素-2123C/G基因中的G等位基因也许是房颤合并血栓的一个致病基因，而C等位基因也许是该疾病的保护基因。然而，国内相关研究也存在争议，曾国良[3]研究结果表明，-1817C/T的各基因型和房颤血栓事件的发病风险无关。张德凯[4]也发现-2123C/G、-1817C/T的基因多态性与房颤发病风险无明显相关性。李滔等[17]则发现P-选择素的基因Ser290Asn位点的多态性不是缺血性的脑卒中的发病危险因素。

从以上的结果来看，在血栓形成的事件中，P-选择素基因的多态性发挥着重要的作用，因仍存在争议，本课题研究在扩大样本量的基础上，进一步研究房颤患者及房颤合并血栓患者P-选择素基因-2123C＞G（rs1800807）、-1817T＞C（rs1800808）两个位点的基因多态性，结果显示：3组比较，P-选择素的-2123C＞G、-1817T＞C位点的等位基因、基因型的分布及显性模型、隐性模型的差异有统计学意义；房颤血栓组的P-选择素-2123C＞G的G等位基因、GG基因型比例较房颤组、正常对照组增高。房颤组P-选择素-1817T＞C的T等位基因、TT基因型比例较房颤血栓组、正常对照组高。进一步行Logistic回归分析，P-选择素基因-2123C＞G位点各遗传模型对房颤患者发生血栓作用不显著。而-1817T＞C位点中房颤患者表现为隐性模型时发生血栓事件的风险是2.147倍，提示P-选择素的基因-2123C＞G、-1817T＞C位点存在多态性，也许是房颤血栓形成的危险因素。这也从另一个角度证实了，SNP在不同地域、不同个体间有差异，引起这种差异的原因，可能是由于单一的基因的多态性效应比较弱，基因的作用效应和遗传背景、环境因素、所在地区密切相关；不同基因间可能存在连锁不平衡，会影响结果的一致性；此外还有统计方法的差异；实验设计的差异，如样本量不足、不严格的实验设计、抽样误差等。

相对于分析基因的多态性，对疾病和基因单体型的分析，有助于确定疾病致病的候选基因及其周围的染色体在疾病发生过程中的相关作用，或者发现与疾病有关的遗传学标志。Cihan等[18]评估了P-选择素的四个单核苷酸的多态性（SNPs）：启动子区域（c.2123C＞G），编码区（S290N，c.1087G＞A；D562N，c.1902G＞A；T715P，c.2363A＞C），结果发现对照组中最常见的单倍型是CGGA，血栓组最常见的单倍型是GGAA，与CGGA相比，部分单倍型增加了深静脉血栓的风险。本研究对P-选择素基因-2123C＞G（rs1800807）、-1817T＞C位点（rs1800808）进行单体型分析，4种单体型分别为CC、CT、GC、GT。在房颤血栓组和房颤组比较中，携CC单体型优势比（OR=1.378，95%CI：1.047～1.814），GC单体型优势比（OR=1.373，95%CI：1.059～1.781），提示CC、GC单体型可能使房颤患者发生血栓事件的风险增加。

综上所述，P-选择素基因多态性可能是房颤血栓事件的一个遗传性标志。目前中国对于房颤合并血栓患者的P-选择素基因多态性的研究较少，尤其新疆地区的研究不多，了解人群的基因分布及遗传特征，可以帮助我们解释疾病发生发展的作用机制，从分子水平探讨房颤血栓事件的原因。P-选择素多个位点都有基因多态性存在，此次仅研究了两个位点，其他位点仍需进一步分析，探讨P-选择素基因多态性是否存在地域性差异，以期能够从基因层面去发现疾病、治疗疾病。